Vienas buteliukas, du taikiniai: nešiojama CRISPR pagrįsta tuberkuliozės diagnostika su 100 % jautrumu

Žurnale „Science Advances“ buvo paskelbtas straipsnis apie nešiojamąjį tuberkuliozės testą, kurį galima atlikti tiesiai iš skreplių, be sudėtingos įrangos. Viename mėgintuvėlyje derinami izoterminė DNR amplifikacija ir CRISPR nuskaitymas; vienu metu tiriami du konservatyvūs M. tuberculosis įterpimai (IS6110 ir IS1081), o kaip vidinė mėginio kontrolė – žmogaus genas. Atliekant nedidelį „aklą“ testą su klinikiniais mėginiais, testo jautrumas buvo 100 % (6/6) ir specifiškumas 100 % (7/7), palyginti su kultūra; aptikimo riba imituotose skrepliuose yra ~69–81 CFU/ml. Rezultatą galima matyti ant popierinės testo juostelės, o reagentai yra liofilizuoti (laikomi be „šaltos grandinės“).

Fonas

Pasak PSO, 2023 m. tuberkuliozė nusineš apie 1,25 mln. žmonių gyvybių; tuberkuliozė vėl tapo pagrindine infekcine mirties priežastimi – užregistruota apie 10,8 mln. atvejų. Dėl to prieinama ir greita diagnostika yra itin svarbi, ypač ribotų išteklių aplinkoje.

• Dabartiniai testai yra kompromisas tarp tikslumo, greičio ir kainos. „Auksinio standarto“ kultūra yra labai tiksli, bet lėta; mikroskopija yra greita, bet nejautri; PGR platformos, tokios kaip „Xpert MTB/RIF Ultra“, yra žymiai jautresnės (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), tačiau joms reikalinga brangi įranga ir kasetės, o tai riboja aprėptį.
• Kodėl izoterminis ir CRISPR? Izoterminis RPA amplifikavimas veikia 37–42 °C temperatūroje ir nereikalauja terminių ciklerų – patogu „lauke“. CRISPR nuskaitymas (Cas12/13) padidina rūšių specifiškumą ir leidžia vizualiai matuoti šoninį srautą („išbraukimą“) be sudėtingos optikos. Apskritai tai yra kelias į nešiojamus ir pigius PVR testus.
• Kodėl vienu metu veikia du MBT taikiniai (IS6110 + IS1081). IS6110 yra daugiakopinis M. tuberculosis komplekso įdėklas, tačiau kai kurios linijos turi mažai kopijų, o vien IS6110 tyrimai gali būti „nepatikimi“. Pridėjus antrą IS1081 įdėklą, sumažėja klaidingai neigiamų rezultatų rizika.
• Kodėl reikalinga vidinė žmogaus kontrolė? Iškvėpto oro mėginiuose gali būti inhibitorių ir „blogų“ mėginių. Endogeninė žmogaus kontrolė (pvz., RNazė P / genominė DNR) patvirtina, kad medžiaga yra tinkama ir reakcija nėra slopinama – kitaip rezultato negalima laikyti neigiamu.
• Vieno indo formatas pats savaime yra svarbus. Jis sumažina veiksmų skaičių, sumažina užteršimo riziką ir palengvina darbą už laboratorijos ribų. Tokie tuberkuliozės gydymo metodai jau parodė gyvybingumą; naujame darbe idėja išplečiama iki dviejų taikinių formato su vidinėmis kontrolėmis, taip pat demonstruojamas reagentų liofilizavimas ir juostelių skaitytuvas.
• Kokia šio straipsnio vertė? Autoriai pademonstravo aptikimą tiesiai iš skreplių po paprasčiausio mėginio paruošimo, aptikimo ribą ties ~70–80 CFU/ml imituotose skrepliuose ir 100 % jautrumą / specifiškumą mažame aklame klinikinių mėginių rinkinyje – gera „technologinė demonstracija“ tolesniems daugiacentriams patvirtinimams.

Kaip tai veikia

• Mokslininkai sujungė RPA (greitą izoterminę genetinės medžiagos amplifikaciją 37 °C temperatūroje) su „pjaustymo“ fermentais Cas13a/Cas12a. Pasirinkę kreipiamąsias RNR, jie sukonfigūravo sistemą taip, kad ji vienu metu ir lygiagrečiai su žmogaus DNR būtų nukreipta į du MBT taikinius (patikrindama, ar mėginyje apskritai yra medžiagos ir ar reakcija „nesustojo“).
• Visa chemija supilama į vieną mėgintuvėlį; po inkubacijos rezultatas nuskaitomas fluorimetru arba šoninio srauto juostele – iš esmės kaip greitojo testo metu.
• Skreplių apdorojimas buvo supaprastintas iki kaitinimo ir trumpos centrifugos – be nukleorūgščių ekstraktoriaus. Ribotomis sąlygomis autoriai netgi aptaria rankines centrifugos alternatyvas.

Ką parodė testai

• Aptikimo riba: 69,0 KFV/ml (H37Rv padermė) ir 80,5 KFV/ml (BCG) „smaigaliuose“ skrepliuose. Kryžminio reaktyvumo su kitomis bakterijomis / grybais nenustatyta.
• Klinikinė aplinka (akli mėginiai): iš 13 mėginių iš realios praktikos – 100 % jautrumas (6/6) ir 100 % specifiškumas (7/7), palyginti su sėjimu. Palyginimui, tame pačiame rinkinyje „GeneXpert Ultra“ parodė atitinkamai 100 % / 86 %.
• Techniniai niuansai: iš dviejų skaitymo variantų geriau veikė Cas13a („vieno indo“ formatui jis yra jautresnis nei Cas12a). Be to, lygiagretus dviejų Mtb taikinių testavimas sumažina klaidingų rezultatų riziką.

Kodėl tai būtina?

Šiandieniniai testai yra kompromisas tarp tikslumo, greičio ir prieinamumo: pasėlis yra labai tikslus, bet lėtas; tepinėlių tyrimai yra greiti, bet netikslūs; PGR sistemos, tokios kaip „GeneXpert“, yra tikslios ir greitos, tačiau joms reikia brangių prietaisų ir kasečių. Naujasis CRISPR metodas siekia užpildyti šią spragą: lauko diagnostika, veikianti 37 °C temperatūroje, rodmenimis naudojant popierines juosteles ir turinti galimybę laikyti reagentus be šaldymo.

Apribojimai ir kas toliau

Tai ankstyva demonstracija nedideliame klinikiniame rinkinyje – reikalingi dideli, daugiacentriai tyrimai (įskaitant ŽIV koinfekciją vaikams, su mažai bakterijų formomis ir skirtingomis MBT linijomis). Autoriai atskirai pažymi, kad pačioje „lauko“ versijoje stalo centrifugą reikės pakeisti visiškai rankiniu sprendimu. Tačiau pati architektūra – „du taikiniai + vidinė kontrolė“ viename mėgintuvėlyje – jau įrodė savo veikimą ir atveria aiškų kelią tobulinimui masiniam naudojimui.

Šaltinis: Alexandra G. Bell ir kt. Supaprastintas CRISPR pagrįstas tuberkuliozės nustatymo testas tiesiai iš skreplių, „Science Advances“, internetinis leidinys, 2025 m. rugpjūčio 6 d. (11 tomas, 32 leidimas). DOI: 10.1126/sciadv.adx206