Laboratorinė tuberkuliozės diagnostika

Tuberkuliozė yra liga, kurią šiuolaikinėmis sąlygomis ir mokslo pasiekimais lengva diagnozuoti. Laboratorinė tuberkuliozės diagnostika užima centrinę vietą tarp kitų diagnostikos metodų, nusileisdama tik rentgeno tyrimo metodams.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Klinikinis kraujo tyrimas

Sergant tuberkulioze, bendro kraujo tyrimo pokyčiai nėra patognomoniniai. Esant ribotoms ir mažai aktyvioms tuberkuliozės formoms, būdinga eritrocitų hipochromija su normaliu skaičiumi. Esant masyviems infiltratams ar kazeozinei pneumonijai, išplitusiam kazeoziniam limfadenitui, specifiniam žarnyno pažeidimui, taip pat esant dideliems plaučių ar pooperaciniams kraujavimams, pastebima eritropenija ir mikrocitozė, oligochromazija, polichromazija. Makrocitozė, ypač poikilocitozė, pasitaiko daug rečiau, dažniausiai esant sunkiai anemijai. Retikulocitų skaičius kompensuotoje tuberkuliozės stadijoje svyruoja nuo 0,1 iki 0,6 %, subkompensuotoje – nuo 0,6 iki 1,0 %, o dekompensuotai – 1 % retikulocitų.

Kai kuriais tuberkuliozės atvejais gali būti stebima vidutinio sunkumo leukocitozė (iki 15 tūkst. leukocitų), rečiau leukopenija, kuri pasireiškia 2–7 % atvejų pacientams, sergantiems ribota ir lengva proceso forma, ir 12,5 % atvejų, kai yra destruktyvi ir progresuojanti plaučių tuberkuliozė.

Dažniausiai pokyčiai pasireiškia leukocitų formulėje. Pastebimas tiek santykinis, tiek absoliutus neutrofilija, vidutinis leukocitų formulės poslinkis į kairę promielocitų link. Mielocitai labai retai aptinkami nesudėtingos tuberkuliozės atvejais. Padidėjęs patologinio granuliarumo neutrofilų skaičius tuberkulioze sergančio paciento hemogramoje visada rodo proceso trukmę: sunkia tuberkuliozės forma sergantiems pacientams beveik visi neutrofilai pasižymi patologiniu granuliarumu. Tuberkuliozės protrūkiui atslūgus, branduolio poslinkis gana greitai grįžta į normalias reikšmes. Patologinis neutrofilų granuliarumas paprastai išlieka ilgiau nei kiti hemogramos pokyčiai.

Eozinofilų kiekis periferiniame kraujyje taip pat svyruoja priklausomai nuo proceso fazės ir organizmo alerginės būsenos. Jų skaičius sumažėja iki aneozinofilijos esant sunkiems ir užsitęsusiems ligos protrūkiams ir, atvirkščiai, padidėja rezorbuojant infiltratus ir pleuros ertmėje, taip pat ankstyvosiose pirminės tuberkuliozės formose.

Dauguma pirminės tuberkuliozės formų lydi limfopenija, kuri kartais stebima kelerius metus net ir po specifinių pakitimų randėjimo. Antrinė tuberkuliozė ūminėje fazėje, priklausomai nuo proceso sunkumo, gali būti lydima arba normalaus limfocitų skaičiaus, arba limfopenija.

Tarp tuberkuliozės proceso vertinimo tyrimų ypatingą vietą užima eritrocitų nusėdimo greičio (ESR) nustatymas, kuris yra svarbus vertinant tuberkuliozės proceso eigą ir nustatant jo aktyvias formas. ESR padidėjimas rodo patologinio proceso (infekcinio-uždegiminio, pūlingo, septinio, hemoblastozės, limfogranulomatozės ir kt.) buvimą ir yra jo sunkumo rodiklis, tačiau normalios ESR vertės ne visada rodo patologijos nebuvimą. Eritrocitų nusėdimo pagreitėjimą skatina padidėjęs globulinų, fibrinogeno, cholesterolio kiekis kraujyje ir sumažėjęs kraujo klampumas. Eritrocitų nusėdimo sulėtėjimas būdingas būklėms, kurias lydi hemokoncentracija, albuminų ir tulžies rūgščių kiekio padidėjimas.

Tuberkulioze sergančių pacientų hemograma gydymo metu kinta. Kuo sėkmingesnė terapinė intervencija, tuo greičiau išnyksta hematologiniai pokyčiai. Kartu reikia nepamiršti įvairių antibakterinių vaistų poveikio kraujodarai. Jie dažnai sukelia eozinofiliją, kai kuriais atvejais – leukocitozę, o dažniau – leukopeniją iki agranulocitozės ir limfoidinės-retikulinės reakcijos. Sistemingas hematologinis stebėjimas ir teisinga gautų duomenų analizė yra būtini norint įvertinti paciento klinikinę būklę, proceso dinamiką ir gydymo veiksmingumą.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Klinikinė šlapimo analizė

Šlapimo takų tuberkuliozės atveju pagrindinis laboratorinis diagnostikos metodas yra šlapimo tyrimas. Gali būti stebima leukociturija, eritrociturija, proteinurija, hipoizostenurija, tuberkuliozinė mikobakteriurija, nespecifinė bakteriurija.

Leukociturija yra dažniausias šlapimo takų tuberkuliozės simptomas prieš specifinę chemoterapiją ir nebūna tik išimtiniais atvejais, pavyzdžiui, visiškai užblokavus šlaptakio spindį. Nečiporenkos testas (leukocitų skaičiaus nustatymas 1 ml šlapimo) padeda objektyviau įvertinti leukociturijos laipsnį sergant nefrotuberkulioze, o kai kuriais atvejais ją nustatyti atlikus įprastą bendrą šlapimo tyrimą. Tačiau reikia atsižvelgti į tai, kad leukociturija gali pasireikšti sergant ūminiu ir lėtiniu pielonefritu, cistitu, uretritu, inkstų akmenlige ir šlaplėmis.

Eritrociturija, kaip ir leukociturija, laikoma vienu iš dažniausių laboratorinių urogenitalinės tuberkuliozės požymių. Hematurijos dažnis priklauso nuo proceso paplitimo; jis didėja vystantis destruktyviam tuberkulioziniam procesui inkstuose. Eritrociturija be leukociturijos labiau būdinga ankstyvosioms inkstų tuberkuliozės stadijoms. Hematurija, vyraujanti prieš leukocituriją, yra svarbus argumentas, patvirtinantis inkstų tuberkuliozę, diferencijuojant ją nuo nespecifinio pielonefrito.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biocheminis kraujo tyrimas

Sergant tuberkulioze, kai kurių biocheminių rodiklių pokyčiai pirmiausia priklauso nuo proceso fazės, komplikacijų ir įvairių gretutinių ligų. Sergant neaktyvia plaučių ir kitų organų tuberkulioze, bendras kraujo serumo baltymų kiekis ir baltymų frakcijos nepakinta ir lemia jų normalų kiekį.

Ūminėse ligos formose, taip pat paūmėjus ir progresuojant lėtinėms tuberkuliozės formoms, albumino-globulino koeficientas mažėja.

Vertinant kepenų funkcinę būklę ir organinius pažeidimus sergant tuberkulioze ir jos komplikacijomis, labai svarbu nustatyti tiesioginio ir bendrojo bilirubino, aspartato aminotransferazės (AST), alanino aminotransferazės (ALT) kiekį kraujo serume. Dinaminis aminotransferazių lygio nustatymas. Bilirubino kiekio nustatymas gydant tuberkuliozę, ypač sunkiomis jos formomis, yra privaloma biocheminio tuberkulioze sergančių pacientų tyrimo dalis ir atliekamas kas mėnesį.

Inkstų funkcinės būklės įvertinimas apima kreatinino kiekio serume nustatymą ir glomerulų filtracijos greičio apskaičiavimą naudojant Cockcroft-Gault formulę. Glomerulų filtracijos greičio apskaičiavimas naudojant Rebergo testą duoda mažiau tikslius rezultatus.

Pagrindinis dinaminių biocheminių tyrimų tikslas pacientams, sergantiems tuberkulioze, yra stebėti proceso eigą, laiku nustatyti vaistų šalutinį poveikį ir tinkamai ištaisyti atsirandančius homeostazės sutrikimus.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Biocheminių tyrimų metodų taikymas ekstrapulmoninėje tuberkulioze

Informatyviausiu rodikliu laikomas tuberkulostearino rūgšties kiekis biologiniuose skysčiuose, tačiau jo nustatymas yra susijęs su techniniais sunkumais (poreikis naudoti dujų chromatografiją ir masių spektrometriją).

Perspektyvu matuoti adenozino deaminazės – fermento, nustatomo skysčiuose: sinoviniame, perikardo, ascitinio arba smegenų skysčiuose, aktyvumą. Pagrindiniai adenozino deaminazės gamintojai yra limfocitai ir monocitai. Adenozino deaminazės aktyvumo nustatymas biologiniuose skysčiuose palengvina tuberkuliozinio sinovito, limfmazgių tuberkuliozės, tuberkuliozinio meningito, tuberkuliozinio serozito diagnozę.

Kai kurie biocheminiai rodikliai dėl savo nespecifiškumo nustatomi tik biologiniuose skysčiuose, esančiuose arti pažeidimo vietos. Rodiklių lygis matuojamas reaguojant į tuberkulino poodinį arba intraderminį suleidimą (paprastai prieš suleidimą ir 48 bei 72 valandas po jo). Po to apskaičiuojamas žymens lygio padidėjimo laipsnis (%), palyginti su pradiniu lygiu.

Optimaliai organui specifinio fermento transamidinazės aktyvumas nustatomas šlapime; jo atsiradimas pastebimas esant įvairios kilmės inkstų pažeidimams. Transamidinazės tyrimas pateisinamas tik tais atvejais, kai tuberkulinas leidžiamas po oda, siekiant paūminti vietinį uždegiminį procesą. Transamidinazės aktyvumas nustatomas šlapime iš pradžių ir praėjus 24–72 valandoms po 50 TE tuberkulino suleidimo. Fermenturijos padidėjimas 2 ar daugiau kartų 82 % atvejų leidžia atskirti aktyvią inkstų tuberkuliozę nuo lėtinio pielonefrito paūmėjimo.

Sergant moterų lytinių organų tuberkulioze, haptoglobino ir malondialdehido koncentracijos kraujyje nustatomos provokacinio tuberkulino testo sąlygomis. Tuberkulinas leidžiamas po oda 50 TE doze, o po 72 valandų atliekamas pakartotinis biocheminis tyrimas. Tuberkuliozės etiologijos atveju haptoglobino kiekio padidėjimo laipsnis yra ne mažesnis kaip 28 %, o malondialdehido kiekis – 39 % ar daugiau. Taip pat naudojamas adenozino deaminazės aktyvumo nustatymas pilvaplėvės skystyje, gautame iš Douglas maišelio. Punktūra pakartotinai tiriama praėjus 72 valandoms po tuberkulino suleidimo į odą 0,1 TE ir 0,01 TE dozėmis vidinių lytinių organų projekcijos srityje ant priekinės pilvo sienos. Adenozino deaminazės aktyvumo padidėjimas 10 % ar daugiau, palyginti su pradine verte, rodo tuberkuliozinį procesą.

Akių pažeidimo atveju tiriama židinio reakcija, atsirandanti akyje reaguojant į antigeno stimuliaciją. Šiuo atveju nepageidautina, kad pasireikštų ryški reakcija, lydima regos funkcijų sumažėjimo. Kadangi minimalių židinio reakcijų įvertinimas dažnai yra sudėtingas, rekomenduojama lygiagrečiai sutelkti dėmesį į haptoglobino ar adenozino deaminazės padidėjimo laipsnį kraujo serume, kad būtų galima objektyvizuoti išvadą.

Visi biocheminiai tyrimai turėtų būti atliekami kartu su kitais metodais.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Kraujo krešėjimo sistemos tyrimas

Kraujo krešėjimo sistemos būklės tyrimo aktualumas ftiziologijoje atsiranda dėl hemoptizės ar plaučių kraujavimo daugeliui pacientų, sergančių plaučių tuberkulioze, taip pat dėl hemokoaguliacijos komplikacijų chirurginio tuberkuliozės gydymo metu. Be to, natūraliai lydinti latentinė intravaskulinė hemokoaguliacija turi įtakos ligos eigai ir chemoterapijos veiksmingumui.

Pacientams, sergantiems plaučių tuberkulioze, kai vyrauja eksudacinis uždegimo komponentas, pastebimas kraujo antikoaguliacinio aktyvumo sumažėjimas. Pacientams, kuriems specifinis plaučių pažeidimas yra mažas, kai vyrauja produktyvus uždegimo komponentas, intravaskulinė hemokoaguliacija yra nereikšminga. Pacientams, sergantiems plaučių tuberkulioze, kai yra hemoptizė ir plaučių kraujavimas, kraujo krešėjimo sistemos būklė yra kitokia: pacientams, kuriems yra nedidelis kraujo netekimas hemoptėjos įkarštyje arba iškart po jos nutraukimo, pastebimas staigus kraujo krešėjimo pajėgumo padidėjimas dėl ryškaus trombino susidarymo procesų suintensyvėjimo, išlaikant padidėjusį „struktūrinį“ krešėjimą. Pacientams, kuriems yra didelis kraujo netekimas, stebimas krešėjimo potencialo sumažėjimas dėl fibrinogeno koncentracijos, XIII faktoriaus aktyvumo ir trombocitų skaičiaus sumažėjimo. Chirurginio gydymo etape pacientams, sergantiems ribotomis plaučių tuberkulioze, reikšmingų homeostazės sistemos sutrikimų neatsiranda. Pacientams, sergantiems išplitusiais procesais, atliekant pneumonektomiją ar pleuropneumonektomiją, dažnai išsivysto DIC sindromas, kuris gali pasireikšti „antrosios ligos“ forma.

Norint stebėti kraujo krešėjimo sistemos būklę pacientams, sergantiems plaučių tuberkulioze, būtina nustatyti aktyvuoto dalinio tromboplastino laiką (APTT), fibrinogeną, trombino laiką, protrombino indeksą, taip pat kraujavimo laiką ir kraujo krešėjimo laiką.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormoniniai tyrimai

Šiuolaikiniai eksperimentiniai ir klinikiniai stebėjimai rodo hormoninės būklės pokyčius esant specifiniam tuberkulioziniam plaučių uždegimui. Įrodyta, kad hipofizės-antinksčių, hipofizės-skydliaukės sistemų ir kasos funkcijos sutrikimų korekcija kartu su prieštuberkulioziniu gydymu prisideda prie fibrogenezės ir reparacijos procesų aktyvacijos specifinio uždegimo židinyje.

Hipofizės-skydliaukės sistemos funkcinė būklė vertinama pagal trijodtironino (T3), tiroksino (T4) ir hipofizės skydliaukę stimuliuojančio hormono (TSH) kiekį kraujo serume _. Nustatyta _, kad subklinikinė hipotirozė nustatoma 38–45 % pacientų, sergančių plaučių tuberkulioze, ir dažniausiai diagnozuojama esant išplitusioms ir fibrozinėms-kaverninėms proceso formoms. Sergant šiomis formomis, labiausiai sumažėja ir T3, ir T4 kiekis _, o šių hormonų _disbalansas pasireiškia padidėjus T4 _/ T3 _santykiui.

Antinksčių žievės funkcija vertinama pagal kortizolio kiekį serume, o kasos endokrininė funkcija – pagal imunoreaktyvaus insulino koncentraciją. Ūminėje infekcinės ligos fazėje padidėja endogeninio kortizolio ir insulino poreikis. Hiperinsulinemija taip pat rodo kūno audinių atsparumą insulinui, kuris būdingas bet kokiam aktyviam uždegiminiam procesui, ypač specifiniam. Antinksčių gliukokortikoidų funkcijos nustatymas sergant aktyvia plaučių tuberkulioze leidžia nustatyti hiperkorticizmą daugumai pacientų. Normali kortizolio koncentracija kraujyje pacientui, sergančiam infekciniu uždegimu ūminiu laikotarpiu, turėtų būti laikoma santykiniu antinksčių žievės gliukokortikoidų funkcijos nepakankamumu, kuris gali būti pakaitinės terapijos su pakankamomis gliukokortikoidų dozėmis pagrindas.

Beveik trečdaliui pacientų, sergančių plaučių tuberkulioze, insulino kiekis yra žemas, artėjantis prie apatinės normos ribos, o 13–20 % – reikšmingas hiperinsulinizmas. Tiek santykinis hipo-, tiek hiperinsulinizmas yra didelės rizikos veiksniai, lemiantys įvairaus sunkumo angliavandenių apykaitos sutrikimų atsiradimą. Šie kasos B ląstelių funkcinio aktyvumo pokyčiai reikalauja reguliariai stebėti glikemiją pacientams, sergantiems tuberkulioze, ir laiku užkirsti kelią cukriniam diabetui. Be to, tai yra papildomas pagrindimas fiziologinių insulino dozių vartojimo tinkamumui kompleksinėje tuberkuliozės terapijoje.

Apskritai skydliaukės hormonų kiekio sumažėjimas, jų disbalansas, hiperkortizolemija ir hiperinsulinizmas yra ryškiausi pacientams, sergantiems sunkia tuberkuliozės proceso eiga, turintiems didelius plaučių pažeidimus ir ryškius tuberkuliozės intoksikacijos simptomus.

Tuberkuliozės mikrobiologinė diagnostika

Mikrobiologiniai tyrimai yra būtini norint nustatyti tuberkulioze sergančius pacientus, patikrinti diagnozę, stebėti ir koreguoti chemoterapiją, įvertinti gydymo rezultatus, kitaip tariant, nuo to momento, kai tuberkulioze sergantis pacientas yra užregistruojamas, iki jo išbraukimo iš registro.

Visos epidemiologinės programos ir projektai yra pagrįsti bakterijų platintojų skaičiaus vertinimu, o to neįmanoma padaryti nenaudojant laboratorinių tuberkuliozės mikobakterijų nustatymo metodų. Nagrinėjant vadinamosios neorganizuotos populiacijos patrauklumą, bakterijų platintojų procentas siekia 70 ar daugiau, todėl laboratoriniai metodai yra gana veiksminga priemonė tuberkulioze sergantiems pacientams nustatyti šioje gyventojų grupėje.

Tradiciniai mikrobiologiniai tuberkuliozės diagnostikos metodai yra bakterioskopiniai ir kultūriniai tyrimai. Šiuolaikiniai metodai apima tuberkuliozės mikobakterijų kultivavimą automatinėse sistemose ir PGR. Tačiau visi šie metodai būtinai derinami su klasikiniais bakteriologiniais metodais.

Diagnostinės medžiagos rinkimas

Laboratorinių tyrimų efektyvumas labai priklauso nuo diagnostinės medžiagos kokybės. Diagnostinės medžiagos rinkimo, saugojimo ir transportavimo taisyklių laikymasis bei tikslus paciento tyrimo algoritmo įgyvendinimas tiesiogiai veikia rezultatą ir užtikrina biologinį saugumą.

Tuberkuliozei tirti naudojamos įvairios medžiagos. Kadangi plaučių tuberkuliozė yra dažniausia tuberkuliozės infekcijos forma, pagrindine tiriamąja medžiaga laikomi skrepliai ir kitos tracheobronchinio medžio išskyros: viršutinių kvėpavimo takų išskyros, gautos įkvėpus aerozolių: bronchų lavažo vanduo; bronchoalveolinis lavažas; medžiaga, gauta bronchoskopijos, transtrachėjinės ir intrapulmoninės biopsijos metu: bronchų aspiratas, gerklų tepinėliai, eksudatai, žaizdų tepinėliai ir kt.

Tyrimo efektyvumas padidėja, jei atliekamas kontroliuojamas medžiagos rinkimas iš paciento. Tam tikslui skiriama specialiai įrengta patalpa arba įsigyjamos specialios kabinos. Medžiagos rinkimas yra pavojinga procedūra, todėl medžiaga tyrimams turi būti renkama laikantis infekcijų saugos taisyklių.

Medžiaga mikobakterijų tuberkuliozės tyrimui surenkama į sterilius buteliukus su sandariai užsukamais dangteliais, siekiant išvengti aplinkos užteršimo ir apsaugoti surinktą medžiagą nuo užteršimo.

Diagnostinės medžiagos rinkimo buteliukai turi atitikti šiuos reikalavimus:

• turi būti pagamintas iš smūgiams atsparios medžiagos;
• autoklavuojant turėtų lengvai ištirpti;
• būti pakankamo tūrio (40–50 ml):
• turėti plačią angą skrepliams surinkti (skersmuo ne mažesnis kaip 30 mm);
• būti lengvai prižiūrimas, skaidrus arba permatomas, kad surinkto mėginio kiekį ir kokybę būtų galima įvertinti neatidarant dangtelio.

Norint gauti optimalius tyrimo rezultatus, turi būti įvykdytos šios sąlygos:

• medžiagos rinkimas turėtų būti atliekamas prieš pradedant chemoterapiją;
• tyrimo medžiaga turi būti surinkta prieš valgant ar vartojant vaistus ryte;
• Tyrimui patartina surinkti bent 3 rytinius skreplių mėginius. Skrepliai renkami 3 dienas iš eilės;
• Surinkta medžiaga turi būti kuo greičiau pristatyta į laboratoriją:
• tais atvejais, kai medžiagos neįmanoma nedelsiant pristatyti į laboratoriją, ji laikoma šaldytuve 4 °C oro temperatūroje ne ilgiau kaip 48 valandas;
• Transportuojant medžiagą, būtina atkreipti ypatingą dėmesį į butelių vientisumą.

Teisingai surinkti skrepliai yra gleivingos arba pūlingos konsistencijos. Optimalus tiriamos skreplių dalies tūris yra 3–5 ml.

Skrepliai renkami prižiūrint sveikatos priežiūros darbuotojui. Už skreplių rinkimą atsakingi asmenys privalo užtikrinti, kad būtų laikomasi tam tikrų taisyklių:

• Būtina pacientui paaiškinti tyrimo tikslą ir būtinybę atkosėti ne seiles ar nosiaryklės gleives, o giliųjų kvėpavimo takų skyrių turinį. Tai galima pasiekti dėl produktyvaus kosulio, atsirandančio po kelių (2–3) gilių įkvėpimų. Taip pat būtina įspėti pacientą, kad pirmiausia jis turi praskalauti burną virintu vandeniu, kad pašalintų pagrindinę burnos ertmėje augančios mikrofloros dalį ir maisto likučius, kurie apsunkina skreplių tyrimą;
• Medicinos darbuotojas, dalyvaujantis skreplių rinkime, be chalato ir kepurės, privalo dėvėti kaukę, gumines pirštines ir guminę prijuostę;
• stovint už paciento, jam patariama laikyti buteliuką kuo arčiau lūpų ir nedelsiant atskirti skreplius, kai jis juos kosėja, tuo pačiu užtikrinant, kad oro srautas būtų nukreiptas nuo sveikatos priežiūros darbuotojo:
• Baigus skreplių surinkimą, sveikatos priežiūros darbuotojas turėtų atsargiai uždaryti buteliuką dangteliu ir įvertinti surinktų skreplių kiekį bei kokybę. Tada buteliukas paženklinamas ir dedamas į specialią dėžę transportavimui į laboratoriją.

Jei pacientas neskreplioja, naktį prieš mėginio paėmimą ir anksti ryte mėginio paėmimo dieną jam reikia duoti atsikosėjimą lengvinančių vaistų: zefyrų šaknų ekstrakto (mukaltino), bromheksino, ambroksolio ir kt. arba naudoti dirginamąjį inhaliacinį vaistą, naudojant patalpoje įrengtą skreplių rinkimo įrangą. Tokiu būdu surinkta medžiaga nekonservuojama ir turi būti ištirta surinkimo dieną. Siekiant išvengti jos „atmetimo“ laboratorijoje, siuntime reikia padaryti specialų įrašą.

Jei mikrobiologiniai tyrimai neatliekami konkrečioje įstaigoje, surinkta diagnostinė medžiaga į laboratoriją turi būti pristatyta centralizuotai, su sąlyga, kad medžiaga tarp pristatymų būtų laikoma šaldytuve arba su konservantais. Medžiaga į laboratoriją pristatoma transportavimo dėžėse, kurias galima lengvai dezinfekuoti. Kiekvienas mėginys turi būti paženklintas atitinkama etikete, o visa partija turi turėti užpildytą lydraštį.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Pacientų apžiūros būdai ir dažnumas

Atliekant pradinį, vadinamąjį diagnostinį, paciento tuberkuliozės tyrimą, būtina ištirti bent 3 skreplių porcijas, surinktas prižiūrint medicinos personalui per 2 ar 3 dienas, o tai padidina mikroskopijos efektyvumą.

Pirminį tuberkuliozės patikrinimą turėtų atlikti visos sveikatos priežiūros sistemos medicinos ir diagnostikos įstaigos. Pastaruoju metu, siekiant padidinti pirminio tyrimo efektyvumą, klinikinių diagnostikos laboratorijų pagrindu buvo organizuoti vadinamieji mikroskopijos centrai, aprūpinti moderniais mikroskopais ir įranga, užtikrinančia epideminį saugumą.

Kovos su tuberkulioze įstaigos naudoja apklausos schemą, pagal kurią per 3 dienas atliekamas bent 3 skreplių ar kitos diagnostinės medžiagos tyrimas. Gydymo metu mikrobiologiniai tyrimai intensyvios chemoterapijos fazėje atliekami reguliariai, bent kartą per mėnesį. Pereinant į stebėjimo fazę, tyrimai atliekami rečiau – kas 2–3 mėnesius, o tyrimų dažnumas sumažinamas iki dviejų.

Diagnostinės medžiagos, skirtos ekstrapulmoninei tuberkuliozei, rinkimo ypatybės

Patologinės medžiagos, esančios ekstrapulmoninėse tuberkuliozės formose, bruožas yra maža mikobakterijų tuberkuliozės koncentracija joje, kuriai reikalingi jautresni mikrobiologinių tyrimų metodai, pirmiausia sėjos ant maistinės terpės metodai.

Urogenitalinės tuberkuliozės atveju šlapimas yra labiausiai prieinama medžiaga tyrimui. Šlapimo surinkimą turėtų atlikti specialiai apmokyta slaugytoja.

Išoriniai lytiniai organai plaunami vandeniu ir muilu arba silpnu kalio permanganato tirpalu. Kruopščiai apdorojama išorinė šlaplės anga. Vidurinė rytinio šlapimo dalis surenkama į sterilų buteliuką: vyrams – natūraliai, moterims – naudojant kateterį. Šlapimas iš inkstų geldelės surenkamas į sterilius mėgintuvėlius kateterizuojant vieną ar du inkstus, pastaruoju atveju – būtinai atskirai iš kiekvieno inksto. Nedidelis šio šlapimo kiekis centrifuguojamas, tiriamos nuosėdos.

Vyrams sperma, sėklidžių punkcijos ir prostatos sekretas centrifuguojami, kad būtų gautos nuosėdos. Esant bet kokiai specifinio proceso lokalizacijai lytinių organų srityje vyrams, prostatos masažas gali skatinti tuberkuliozės mikobakterijų turinčių sekretų išsiskyrimą.

Menstruacinis kraujas iš moterų surenkamas siurbimu arba naudojant Kafkos kepurėlę. Gauta medžiaga nuo eritrocitų atskiriama plaunant ją distiliuotu vandeniu ir centrifuguojant. Ištirtos nuosėdos.

Iš gimdos kaklelio kanalo išskyros surenkamos į tam tikrą indą arba Kafkos dangtelį, tai yra, pageidautina sukaupti 1-2 ml patologinės medžiagos.

Medžiaga, gauta atliekant chirurgines intervencijas į inkstus, lytinius organus, atliekant biopsijas, endometriumo grandines, yra homogenizuojama. Tam ji dedama į sterilų grūstuvą ir kruopščiai sutrinama steriliomis žirklėmis. Į gautą suspensiją įpilama sterilaus upės smėlio tokiu kiekiu, koks yra jos masė, tada įpilama 0,5–1,0 ml izotoninio natrio chlorido tirpalo ir viskas sumalama, kol susidaro košės konsistencijos masė, įpilant izotoninio natrio chlorido tirpalo (4–5 ml). Tada masei leidžiama nusistovėti 1–1,5 minutės, tiriamas supernatantas.

Kaulų ir sąnarių tuberkuliozė. Steriliu švirkštu paimtas pūlinys (pūliai iš abscesų) dedamas į sterilų indą ir nedelsiant pristatomas į laboratoriją. Steriliu pipete, prieš tai sudrėkintu steriliu izotoniniu natrio chlorido tirpalu, paimama 2–5 ml pūlių, perpilama į buteliuką su karoliukais ir įpilama dar 2–3 ml izotoninio natrio chlorido tirpalo. Butelis užkemšamas kamščiu ir 8–10 minučių kratomas kratytuve. Apžiūrima homogenizuota suspensija.

Esant fistulinėms osteoartikulinės tuberkuliozės formoms, iš fistulės paimami pūliai. Gausūs išskyros surenkamos tiesiai į mėgintuvėlį. Esant negausiems pūlių išskyroms, fistulės traktas praplaunamas steriliu izotoniniu natrio chlorido tirpalu, o į mėgintuvėlį arba pūliais suvilgytą tampono gabalėlį surinktas nuoplovas siunčiamas tyrimui.

Chirurginės intervencijos į kaulus ir sąnarius metu gauta chirurginė medžiaga gali būti pūlingos-nekrozinės masės, granuliacijos, randinis audinys, kaulinis audinys, sinovinis membranos audinys ir kiti substratai. Jos apdorojimas atliekamas taip pat, kaip ir inkstų tuberkuliozės atveju.

Iškart po punkcijos atliekamas sinovinio skysčio mikrobiologinis tyrimas 3% natrio citrato tirpale (santykiu 1:1), siekiant išvengti krešėjimo.

Limfmazgių tuberkuliozė. Pūliai, išskirti atliekant limfmazgių punkcijas, tiriami taip pat, kaip ir pūliniai iš abscesų. Limfmazgių audinys, gautas chirurginių intervencijų ir biopsijų metu, tiriamas kaip ir sergant kitomis tuberkuliozės formomis.

Išmatų tyrimas dėl Mycobacterium tuberculosis atliekamas labai retai, nes beveik visiškai nėra teigiamų rezultatų.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikobakterijų mikroskopija

Skreplių mikroskopija yra gana greitas, paprastas ir nebrangus metodas, kuris turėtų būti naudojamas visais atvejais, kai įtariama tuberkuliozė. Be to, šis tyrimas atliekamas siekiant įvertinti chemoterapijos veiksmingumą ir patvirtinti pasveikimą ar gydymo nesėkmę, kai nėra pasėlio rezultatų.

Mikroskopiniam tyrimui naudojami du metodai:

• tiesioginės mikroskopijos metodas, kai tepinėlis paruošiamas tiesiai iš diagnostinės medžiagos;
• kultūriniams tyrimams skirtas nuosėdų, paruoštų iš dezaktyvavimo priemonėmis apdorotos medžiagos, mikroskopijos metodas.

Pirmasis metodas naudojamas tose laboratorijose, kuriose atliekami tik mikroskopiniai tyrimai (bendrojo medicinos tinklo klinikinės diagnostikos laboratorijos).

Geriausi mikroskopinio tyrimo rezultatai gaunami koncentruojant diagnostinę medžiagą (pavyzdžiui, centrifuguojant).

Norint mikroskopu aptikti Mycobacterium tuberculosis su 50 % tikimybe, 1 ml skreplių turi būti daugiau nei 5000 mikrobų ląstelių. Pacientų, sergančių plaučių tuberkuliozės formomis, skrepliuose paprastai būna daug rūgštims atsparių bakterijų, todėl jas galima patikimai aptikti bakterioskopijos būdu. Šio metodo diagnostinį jautrumą galima padidinti ištyrus kelis vieno paciento skreplių mėginius. Neigiamas bakterioskopinio tyrimo rezultatas neatmeta tuberkuliozės diagnozės, nes kai kurių pacientų skrepliuose yra mažiau Mycobacterium, nei galima aptikti mikroskopu. Netinkamai paruošti skreplių tepinėliai taip pat gali būti neigiamo bakterioskopinio tyrimo rezultato priežastis.

Dažniausias rūgštims atsparių mikobakterijų aptikimo tepinėlyje metodas yra Ziehl-Neelseno dažymas. Metodas pagrįstas karbolio fuksino prasiskverbimu į mikrobų ląstelę per membraną, kurioje yra vaško-lipidų sluoksnis, tuo pačiu metu veikiant kaitinimui ir stipriam fenolio ėsdinimui. Vėlesnis tepinėlio spalvos padengimas 25% sieros rūgšties arba 3% druskos alkoholio tirpalu lemia visų rūgštims neatsparių struktūrų spalvos padengimą. Nudažyti tepinėlio elementai dažomi 0,3% metileno mėlynojo tirpalu. Mikobakterijos nesuvokia įprastų anilino dažų, todėl rūgštims atsparios mikobakterijos nusidažo aviečių raudona spalva, o kiti mikrobai ir ląstelių elementai – mėlyna spalva.

Tepinėlių, nudažytų pagal Ziehl-Neelsen metodą, tyrimui naudojamas šviesinis binokulinis mikroskopas su panardinimo objektyvu (90 arba 100 kartų didinimas) ir okuliaras su 7 arba 10 kartų didinimu. Tiriama 100 regėjimo laukų, kurių pakanka pavienėms mikobakterijoms tepinėlyje aptikti. Jei tokio tyrimo rezultatas neigiamas, patvirtinimui rekomenduojama ištirti dar 200 regėjimo laukų. Rezultatai užrašomi, nurodant aptiktų rūgštims atsparių mikobakterijų (AFB) skaičių.

Be šio metodo, liuminescencinei mikroskopijai naudojamas fluorochrominis dažymas, kuris leidžia pasiekti geriausių rezultatų. Taikant šį metodą, mikroskopijos efektyvumas padidėja 10–15 %. Kai mikobakterijos apdorojamos liuminescenciniais dažais (auraminu, rodaminu ir kt.), šios medžiagos taip pat jungiasi prie vaško pavidalo mikrobinės ląstelės struktūrų. Apšvitinus nudažytas ląsteles jaudinančiu šviesos šaltiniu (tam tikru ultravioletinių spindulių spektru), jos pradeda švytėti oranžine arba ryškiai raudona spalva juodame arba tamsiai žaliame fone. Dėl didelio matomo vaizdo ryškumo ir kontrasto bendras mikroskopo didinimas gali sumažėti 4–10 kartų, o tai išplečia matymo lauką ir sutrumpina preparato matymo laiką. Kartu, dėl žymiai didesnio lauko gylio, galima padidinti tyrimo komfortą.

Naudojant fluorescencinę mikroskopiją, to paties tepinėlio ploto apžiūra trunka žymiai trumpiau nei pagal Ziehl-Neelsen dažymą nudažytų tepinėlių šviesinė mikroskopija. Jei mikroskopuotojas per darbo dieną apžiūri maždaug 20–25 tokius tepinėlius, tai naudodamasis fluorescencine mikroskopija jis per tą patį laiką gali ištirti daugiau nei 60–80 mėginių. Patyrę mikroskopuotojai žino, kad ląstelių dažymas auramino ir rodamino mišiniu tam tikru būdu yra specifinis rūgštims atsparioms mikobakterijoms, kurios šiuo atveju atrodo kaip auksinės lazdelės. Saprofitai nusidažo žalsvai.

Kitas svarbus fluorescencinės mikroskopijos metodo privalumas yra galimybė aptikti pakitusias mikobakterijas, kurios prarado savo atsparumą rūgštims dėl daugelio nepalankių veiksnių, ypač intensyvios chemoterapijos, įtakos, todėl jų neaptinka Ziehl-Neelseno dažymas.

Fluorescencinės mikroskopijos metodo trūkumai yra santykinai didelė mikroskopo ir jo eksploatavimo kaina. Tačiau centralizuotose ar kitose didelėse laboratorijose, kur darbo krūvis viršija trijų laboratorijų technikų, dirbančių su trimis įprastais mikroskopais, normą, pigiau naudoti vieną fluorescencinį mikroskopą.

Bakterioskopiniai metodai pasižymi gana dideliu specifiškumu (89–100 %). Apie 97 % teigiamų rezultatų, gautų bet kuriuo mikroskopijos metodu, aiškiai patvirtina sėjos rezultatai.

Reikėtų pažymėti, kad patologinės medžiagos tepinėlio mikroskopinis tyrimas neleidžia nustatyti aptiktų rūgštims atsparių mikobakterijų rūšies. Mikroskopinis metodas leidžia daryti išvadą tik apie rūgštims atsparių mikroorganizmų buvimą ar nebuvimą preparate, o tai paaiškinama tuo, kad gamtoje yra daug ne tuberkuliozinių rūgštims atsparių mikroorganizmų, morfologiškai panašių į tuberkuliozės komplekso mikobakterijas.

Mikroskopijos rezultatų vertinimas atliekamas pusiau kiekybiniais vienetais.

Norint palyginti skirtingų mikroskopijos metodų rezultatus, įvedami empiriniai koeficientai. Pavyzdžiui, norint palyginti fluorescenciniais dažais nudažyto tepinėlio rezultatus su šviesos mikroskopijos tyrimo (1000 kartų didinimas) duomenimis, reikia fluorescenciniu mikroskopu aptiktų rūgštims atsparių mikobakterijų skaičių padalyti iš atitinkamo koeficiento: esant 250 kartų mikroskopo didinimui – iš 10, esant 450 kartų – iš 4, esant 630 kartų – iš 2.

Ekstrapulmoninės tuberkuliozės mikroskopijos ypatybės

Atliekama tiesioginė mikroskopija, taip pat po sodrinimo paruoštų tepinėlių mikroskopija su vėlesniu dažymu pagal Ziehl-Neelsen arba fluorescencinius dažus. Tiesioginė tepinėlių mikroskopija yra neefektyvi dėl mažos mikobakterijų koncentracijos medžiagoje, todėl racionaliau naudoti sodrinimo metodus. Efektyviausias yra centrifugavimas. Jei biologinė medžiaga yra klampi, naudojamas centrifugavimas su vienu metu vykstančiu medžiagos homogenizavimu ir suskystinimu, kuris atliekamas naudojant didelio greičio centrifugas, kurių centrifugavimo jėga yra 3000 g, ir hipochlorito tirpalus. Kiti sodrinimo metodai, tokie kaip mikroflotacija, šiuo metu nenaudojami dėl biologiškai pavojingų aerozolių susidarymo.

[ 37 ]

Kultūros metodas tuberkuliozei diagnozuoti

Sėjimo metodas, arba kultūros metodas, yra jautresnis nei tepinėlio mikroskopija ir turi daug pranašumų, palyginti su pastaruoju. Jis leidžia aptikti kelias dešimtis gyvybingų mikobakterijų tiriamojoje medžiagoje ir turi didelę diagnostinę vertę. Tai ypač svarbu tiriant medžiagą iš naujai diagnozuotų ar gydytų pacientų, kurie išskiria nedidelį kiekį mikobakterijų.

Palyginti su mikroskopija, kultūriniai tyrimai leidžia daugiau nei 15–25 % padidinti aptinkamų tuberkulioze sergančių pacientų skaičių, taip pat patikrinti tuberkuliozę ankstesnėse stadijose, kai liga dar lengvai gydoma. Labai svarbiu kultūrinių tyrimų privalumu laikoma galimybė gauti patogeno kultūrą, kurią galima identifikuoti ir tirti atsižvelgiant į jautrumą vaistams, virulentiškumą ir kitas biologines savybes.

Auginimo metodų trūkumai yra jų trukmė (medžiagų laukimo laikotarpis siekia 10 savaičių), didesnė kaina ir diagnostinės medžiagos apdorojimo sudėtingumas.

Diagnostinės medžiagos apdorojimo prieš sėją principai

Įprastiniai mikrobiologiniai metodai tuberkuliozės tyrimams atlikti negali būti naudojami. Taip yra dėl to, kad tuberkuliozės mikobakterijos auga labai lėtai, o daugumoje klinikinių mėginių yra greitai augančių pūlingų ir puvimą skatinančių mikroorganizmų bei grybelių. Jų spartus augimas turtingoje maistinių medžiagų terpėje trukdo mikobakterijų vystymuisi ir neleidžia išskirti tuberkuliozės sukėlėjo, todėl diagnostinė medžiaga prieš sėjimą turi būti apdorota. Be to, iš paciento kvėpavimo takų išsiskiriančios mikobakterijos paprastai būna apsuptos dideliu kiekiu gleivių, todėl jas sunku sukoncentruoti. Todėl prieš sėjant skreplius ir kitas panašias medžiagas, jas reikia suskystinti ir dezinfekuoti.

Visi plovikliai ir dezaktyvatoriai turi daugiau ar mažiau ryškų toksinį poveikį mikobakterijoms. Dėl apdorojimo gali žūti iki 90 % mikobakterijų. Norint išsaugoti pakankamą mikobakterijų populiacijos dalį, būtina naudoti švelnius apdorojimo metodus, kurie, viena vertus, leidžia slopinti greitai augančius pūlingus ir puvimo mikroorganizmus, kita vertus, maksimaliai išsaugoti medžiagoje esančių mikobakterijų gyvybingumą.

Priklausomai nuo medžiagos, jos homogeniškumo ir užterštumo lygio, prieš sėją apdorojimui naudojami įvairūs dezaktyvatoriai: skrepliams – 4 % natrio hidroksido tirpalas, 10 % trinatrio fosfato tirpalai, benzalkonio chlorido trinatrio fosfatas, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteino-natrio hidroksidas), kurio galutinė NaOH koncentracija yra 1 %, šlapimui ir kitoms skystoms medžiagoms – 3 % sieros rūgšties tirpalas, užterštiems mėginiams, riebalus turinčioms medžiagoms – oksalo rūgšties tirpalas iki 5 %. Be to, kai kuriais atvejais naudojami fermentai ir paviršinio aktyvumo medžiagos (plovikliai). Tween ir kai kurių kitų ploviklių naudojimas sumažina mikobakterijų ląstelių žūtį (išgyvena 40–50 %). Tačiau juos galima naudoti tik skystoms medžiagoms. NALC-NaOH, gaminamas rinkiniais, yra plačiausiai naudojamas pasaulyje. Šis metodas leidžia išskirti daugiau nei 85 % mikobakterijų ląstelių populiacijos. Audinių turinčių kietų medžiagų dezaktyvavimas yra sudėtingesnis, nes sunku atspėti medžiagos išsisklaidymo laipsnį homogenizacijos metu. Pavyzdžiui, limfmazgių biopsijų apdorojimas dažnai lydimas padidėjusio užterštumo svetima flora. Tokiu atveju galima naudoti 1 % etonio tirpalą.

Nehomogeninė medžiaga homogenizuojama naudojant stiklo karoliukus, esant dezaktyvavimo priemonėms. Skystos medžiagos yra iš anksto centrifuguojamos ir apdorojamos tik nuosėdos.

Sėjos ir inkubacijos technika

Po pirminio apdorojimo medžiaga centrifuguojama, kurios metu nusodinamos mikobakterijos ir padidėja jų kiekis nuosėdose („nuosėdų praturtėjimas“). Gautos nuosėdos neutralizuojamos ir inokuliuojamos ant tankios maistinės terpės arba mėgintuvėlių su skysta (pusiau skysta) terpe paviršiaus. Iš likusių nuosėdų paruošiami tepinėliai mikroskopiniam tyrimui. Sėjimo technika turi užkirsti kelią diagnostinės medžiagos kryžminiam užteršimui.

Norint patikimai kliniškai interpretuoti mikrobiologinių tyrimų rezultatus, reikia laikytis šios taisyklės: mikroskopiniai ir kultūriniai tyrimai turi būti atliekami lygiagrečiai iš to paties diagnostinės medžiagos mėginio.

Inokuliuoti mėgintuvėliai 2 dienas horizontalioje padėtyje dedami į 37 ^° C temperatūros termostatą. Tai užtikrina tolygesnį medžiagos įsisavinimą į maistinę terpę. Po 2 dienų mėgintuvėliai perkeliami į vertikalią padėtį ir hermetiškai užsandarinami guminiais arba silikoniniais kamščiais, kad pasėta terpė neišdžiūtų.

Pasėliai 10–12 savaičių laikomi termostate 37 ^° C temperatūroje, reguliariai tikrinant kas savaitę. Kiekvieno kontrolinio patikrinimo metu registruojami šie parametrai:

• vizualiai stebimo augimo laikotarpis nuo sėjos dienos;
• augimo greitis (KFV skaičius);
• kultūros užteršimas svetima mikrobų flora ar grybeliais (tokie mėgintuvėliai pašalinami);
• nėra matomo augimo. Vamzdeliai paliekami termostate iki kito patikrinimo.

Maistinės medžiagos

Mikobakterijoms auginti naudojamos įvairios maitinamosios terpės: kietos, pusiau skystos, skystos. Tačiau nė viena iš žinomų maitinamųjų terpių neturi savybių, užtikrinančių visų mikobakterijų ląstelių augimą. Todėl, siekiant pagerinti efektyvumą, rekomenduojama vienu metu naudoti 2–3 skirtingos sudėties maitinamąsias terpes.

Kaip standartinę terpę pirminiam tuberkuliozės sukėlėjo išskyrimui ir jo jautrumo vaistams nustatymui, PSO rekomenduoja Lowenstein-Jensen terpę. Tai tanki kiaušinėlių terpė, kurioje mikobakterijos auga 20–25 dieną po bakterioskopiškai teigiamos medžiagos pasėjimo. Bakterioskopiškai neigiamos medžiagos pasėjimui reikalingas ilgesnis inkubacinis laikotarpis (iki 10–12 savaičių).

Mūsų šalyje plačiai paplito ER Finno pasiūlyta Finn-II kiaušinių terpė. Ji skiriasi tuo, kad vietoj L-asparagino joje naudojamas natrio glutamatas, kuris suaktyvina kitus aminorūgščių sintezės mikobakterijose kelius. Šioje terpėje augimas prasideda šiek tiek anksčiau, o mikobakterijų išskyrimo dažnis yra 6–8 % didesnis nei Lowenstein-Jensen terpėje.

Siekiant padidinti ekstrapulmoninės tuberkuliozės bakteriologinės diagnostikos efektyvumą, į maitinamųjų terpių kompleksą patartina įtraukti modifikuotą Finn-II terpę. Augimui paspartinti į Finn-II maitinamąją terpę papildomai įvedama 0,05 % natrio tioglikolato, kuris sumažina deguonies koncentraciją. Siekiant apsaugoti mikobakterijų fermentų sistemas nuo toksiškų lipidų peroksidacijos produktų, į Finn-II maitinamąją terpę įvedamas antioksidantas α-tokoferolio acetatas, kurio koncentracija yra 0,001 μg/ml. Diagnostinė medžiaga sėjama standartiniu metodu.

Rusijos kovos su tuberkulioze laboratorijose naudojamos ir kitos tankių maistinių terpių modifikacijos: G. G. Mordovskio pasiūlyta maistinė terpė „Novaja“, V. Anikino sukurtos maistinės terpės A-6 ir A-9 ir kt.

Dėl to, kad chemoterapijos metu pažeidžiamos įvairios mikrobinės ląstelės medžiagų apykaitos sistemos, dalis mikobakterijų populiacijos praranda gebėjimą normaliai vystytis įprastose maitinamosiose terpėse ir joms reikalingos osmosiškai subalansuotos (pusiau skystos arba skystos) maitinamosios terpės.

Diagnostinės medžiagos kultūros rezultatų įvertinimas ir registravimas

Kai kurios mikobakterijų padermės ir rūšys auga lėtai, prieaugis gali pasireikšti net 90-tą dieną. Tokių kultūrų skaičius nedidelis, tačiau dėl to sėjos 2,5–3 mėnesius turi būti laikomos termostate.

Virulentiškos Mycobacterium tuberculosis kultūros paprastai auga ant kietos kiaušinėlių terpės kaip įvairaus dydžio ir išvaizdos R formos kolonijos. Kolonijos yra sausos, raukšlėtos, dramblio kaulo spalvos ir šiek tiek pigmentuotos. Kitose terpėse Mycobacterium tuberculosis kolonijos gali būti drėgnesnės. Po chemoterapijos kurso arba gydymo metu gali būti išskirtos lygios kolonijos su drėgnu augimu (S formos).

Izoliuojant kultūras, naudojamas specialių tyrimų rinkinys, skirtas atskirti tuberkuliozės mikobakterijas nuo ne tuberkuliozinių mikobakterijų ir rūgštims atsparių saprofitų.

Teigiamas atsakymas pateikiamas atlikus privalomą pagal Ziehl-Neelsen nudažytų išaugusių kolonijų tepinėlio mikroskopinį tyrimą. Mikobakterijų augimo atveju tepinėliuose randamos ryškiai raudonos lazdelės, išsidėsčiusios pavieniui arba grupėmis, sudarydamos veltinio ar pynių pavidalo sankaupas. Jaunose kultūrose, ypač tose, kurios buvo išskirtos iš pacientų, ilgą laiką gydytų chemoterapija, mikobakterijos pasižymi ryškiu polimorfizmu, iki trumpų, beveik kokoidinių arba pailgų variantų, primenančių grybelio grybieną, kartu su lazdelės formos formomis.

Mikobakterijų augimo intensyvumas nustatomas pagal šią schemą: (+) – 1–20 KFV mėgintuvėlyje (mažas bakterijų išsiskyrimas); (++) – 20–100 KFV mėgintuvėlyje (vidutinis bakterijų išsiskyrimas); (+++) – >100 KFV mėgintuvėlyje (gausus bakterijų išsiskyrimas). Laboratorinėje tuberkuliozės diagnostikoje nepakanka atsakyti, ar konkrečiu metodu buvo aptiktos mikobakterijos, ar ne. Taip pat būtina turėti išsamų supratimą apie mikobakterijų populiacijos kiekį ir pobūdį, jos sudėtį ir savybes. Būtent šie duomenys leidžia teisingai interpretuoti proceso būklę, planuoti taktiką ir laiku koreguoti gydymą.

Pastaraisiais metais mikobakterijų augimui paspartinti buvo pasiūlytos agaro pagrindu pagamintos maistinės terpės su įvairiais augimo priedais ir specialaus dujų mišinio naudojimas. Siekiant užtikrinti mikobakterijų augimą šiose terpėse, auginimo metu sukuriama atmosfera su padidintu anglies dioksido kiekiu (4–7 %). Šiuo tikslu naudojami specialūs CO2 inkubatoriai _. Tačiau labiausiai išplėtotos automatizuotos mikobakterijų auginimo sistemos: MGIT-BACTEC-960 ir MB/Bact.

Viena iš tokių sistemų yra MGIT (mikobakterijų augimo indikatoriaus) sistema – aukštųjų technologijų kūrinys, skirtas pagreitintai tuberkuliozės bakteriologinei diagnostikai ir mikobakterijų jautrumo pirmos ir kai kuriems antros eilės vaistams nustatymui. MGIT skirtas naudoti kaip VASTEC-960 prietaiso dalis. Mikroorganizmai kultivuojami specialiuose mėgintuvėliuose su skysta maistine terpe, kurios pagrindas yra modifikuota Middlebrook-7H9 terpė. Mikobakterijų augimui skatinti ir svetimos mikrofloros augimui slopinti naudojamas MGIT augimo papildas ir PANTA antibakterinių vaistų mišinys.

Mikroorganizmų augimas registruojamas optiškai. Jis pagrįstas fluorescencija, kuri atsiranda, kai mikobakterijos augimo metu sunaudoja deguonį. Specialaus mėgintuvėlio apačioje yra deguonies priklausomas fluorochromo dažiklis, padengtas silikono sluoksniu. Mikobakterijų dauginimasis sumažina deguonies kiekį mėgintuvėlyje ir jo koncentraciją, dėl to padidėja fluorescencija, kuri tampa matoma, kai mėgintuvėlis apšvitinamas ultravioletiniais spinduliais, ir automatiškai registruojama fotosensoriais, įmontuotais VASTES-960 įrenginyje. Liuminescencijos intensyvumas registruojamas augimo vienetais (GU). Augimo duomenys automatiškai įvedami į kompiuterį, kuriame juos galima išsaugoti. Kompiuterinė augimo kreivių analizė gali suteikti informacijos apie įvairių mikobakterijų, įskaitant ne tuberkuliozines, telkinių buvimą, taip pat padeda įvertinti mikobakterijų augimo savybes.

Įdiegus tokias sistemas, mikobakterijų augimo laikas gerokai sutrumpėjo – vidutiniškai 11 dienų VASTEC-960 terpėje ir 19 dienų MB/Bact terpėje, palyginti su 33 dienomis standartinėje tankioje maistinėje terpėje. Reikėtų pažymėti, kad šioms sistemoms reikalingas aukštos kvalifikacijos personalas. Medžiagos sėjimas į skystas terpes būtinai atliekamas kartu su sėjimu į Lowenstein-Jensen terpę, kuri atlieka atsarginės terpės vaidmenį tais atvejais, kai tuberkuliozės mikobakterijos neauga kitose terpėse.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Mikobakterijų jautrumo vaistams nustatymas

Mikobakterijų spektro ir jautrumo vaistams nuo tuberkuliozės laipsnio nustatymas yra labai svarbus klinikinėje praktikoje, taip pat epidemiologiniam atsparumo vaistams tuberkuliozės plitimo vertinimui. Be to, atsparumo vaistams stebėjimas leidžia įvertinti visos kovos su tuberkulioze programos veiksmingumą, nes tai yra neatsiejamas visų kovos su tuberkulioze priemonių komponentų veikimo rodiklis.

Vaistų jautrumo tyrimų dažnumas ir laikas:

• prieš pradedant gydymą, vieną kartą nustatyti gydymo strategiją ir taktiką:
• Izoliuojant pasėlį iš įvairių paciento medžiagų (skreplių, BAL, šlapimo, eksudatų, smegenų skysčio ir kt.), tiriamos visos išskirtos padermės:
• intensyvios gydymo fazės pabaigoje, kai nėra klinikinės ir radiologinės dinamikos:
• jei reikia keisti gydymo režimą šiais atvejais:
  • skreplių neigiamumo nebuvimas;
  • pakartotinis kultivavimas po skreplių neigiamo tyrimo;
  • staigus AFB kiekio padidėjimas tepinėlyje po pradinio sumažėjimo. Gerai žinoma, kad iš tuberkulioze sergančio paciento medžiagos išskiriamos skirtingo jautrumo vaistams Mycobacterium tuberculosis padermės. Padermių jautrumas vaistams nuo tuberkuliozės gali skirtis vaistų spektru, atsparumo išsivystymo laipsniu, dažnumu ir greičiu.

Mycobacterium tuberculosis atsparumo vaistams laipsnis nustatomas pagal nustatytus kriterijus, kurie yra orientuoti į klinikinę atsparumo reikšmę ir priklauso nuo vaisto antituberkuliozinio aktyvumo, jo farmakokinetikos, koncentracijos pažeidime, didžiausios terapinės dozės ir kt.

Mikobakterijų jautrumo vaistams nustatymas šiuo metu atliekamas naudojant mikrobiologinius metodus:

• absoliučios koncentracijos (skiedimo metodas kietoje arba skystoje maistinių medžiagų terpėje),
• proporcijos,
• varžos koeficientas.

Paprastai atsparumas pasireiškia vizualiai stebimu mikobakterijų tuberkuliozės kolonijų augimu, tačiau yra metodų, kurie skatina augimą ankstyvosiose mikobakterijų ląstelių dalijimosi stadijose spalvinių reakcijų pavidalu. Šie metodai sutrumpina tyrimo laiką nuo 3–4 iki 2 savaičių.

PSO Chemoterapijos komiteto rekomenduojamas absoliučios koncentracijos metodas Rusijoje plačiai paplito kaip vieningas metodas. Metodologiniu požiūriu tai paprasčiausias, tačiau reikalaujantis aukšto laboratorinių procedūrų standartizavimo ir tikslumo. Vaistų jautrumo tyrimas susideda iš mėgintuvėlių su maistine terpe, modifikuota vaistais nuo tuberkuliozės, rinkinio. Rinkinį sudaro 2–3 mėgintuvėliai su skirtinga kiekvieno iš naudojamų vaistų koncentracija, vienas kontrolinis mėgintuvėlis su terpe be vaisto ir vienas mėgintuvėlis su 1000 μg/ml natrio salicilato arba 500 μg/ml paranitrobenzenkarboksirūgšties, skirtos ne tuberkuliozinių mikobakterijų augimui nustatyti.

Terpės su preparatais paruošimui naudojama modifikuota Lowenstein-Jensen terpė (be krakmolo), kuri supilama į kolbas. Į kiekvieną kolbą įpilamas tam tikras tūris atitinkamo prieštuberkuliozinio vaisto skiedinio. Kolbų turinys kruopščiai sumaišomas, supilamas į mėgintuvėlius ir koaguliuojamas pasvirusioje padėtyje 40 minučių 85 °C temperatūroje. Terpę rekomenduojama koaguliuoti elektriniame koaguliatoriuje su automatiniu temperatūros reguliavimu. Terpė su prieštuberkulioziniais vaistais

1-os eilės vaistus galima laikyti šaldytuve 2–4 °C temperatūroje 1 mėnesį, antros eilės vaistus – ne ilgiau kaip 2 savaites. Terpės su vaistais laikyti kambario temperatūroje nepriimtina. Ruošiant vaistų nuo tuberkuliozės tirpalus, atsižvelgiama į jų aktyvumą, koncentraciją skaičiuojant atsižvelgiant į nespecifinės vaisto dalies molekulinę masę, grynumą ir kt. Vaisto jautrumui nustatyti naudojamos tik chemiškai grynos medžiagos.

Metodo principas – nustatyti prieštuberkuliozinio vaisto koncentraciją, kuri slopina reikšmingos mikobakterijų populiacijos dalies augimą. Teisingai atliktas šis metodas yra patikimas.

Prieš atliekant tyrimą, būtina įsitikinti, kad išskirtoje Mycobacterium tuberculosis kultūroje nėra pašalinės mikrofloros. Iš mikobakterijų kultūros 0,9 % natrio chlorido tirpale paruošiama homogeninė suspensija, kurioje yra 500 milijonų mikrobų kūnelių 1 ml (optinio drumstumo standartas 5 vienetai). Gauta suspensija praskiedžiama 0,9 % natrio chlorido tirpalu (1:10) ir į kiekvieną maistinių terpių rinkinio mėgintuvėlį įpilama po 0,2 ml suspensijos. Inokuliuoti mėgintuvėliai dedami į termostatą 37 °C temperatūroje ir 2–3 dienas laikomi horizontaliai, kad pasviręs maistinės terpės paviršius būtų tolygiai inokuliuotas Mycobacterium tuberculosis suspensija. Tada mėgintuvėliai perkeliami į vertikalią padėtį ir inkubuojami 3–4 savaites. Rezultatai užrašomi po 3–4 savaičių.

Kadangi patogeno išskyrimas iš klinikinės medžiagos maistinėse terpėse trunka mažiausiai 1–1,5 mėnesio, vaisto jautrumo nustatymo šiuo metodu rezultatus galima gauti ne anksčiau kaip po 2–2,5 mėnesio nuo medžiagos pasėjimo. Tai yra vienas iš pagrindinių metodo trūkumų.

Mikobakterijų jautrumo vaistams tyrimų rezultatai interpretuojami remiantis tam tikrais kriterijais. Kietose terpėse kultūra laikoma jautria terpėje esančio vaisto koncentracijai, jei mikobakterijų kolonijų skaičius, išaugęs tam tikrame mėgintuvėlyje su vaistu, neviršija 20, o kontroliniame mėgintuvėlyje be vaistų gausiai auga. Tik jei kolonijų yra daugiau nei 20, kultūra laikoma atsparia tam tikrai koncentracijai. Praktiškai, kai augimo rezultatai mėgintuvėliuose artimi 20 KFV, būtina pranešti klinikiniam skyriui, kad jautrumas ar atsparumas šiuo atveju yra ribinis, nes tai kartais gali paaiškinti neaiškią klinikinių rodiklių dinamiką.

Įvairiems preparatams nustatoma tam tikra koncentracija, kuriai esant stebimas kritinės mikobakterijų populiacijos dalies dauginimasis. Šios koncentracijos vadinamos „kritinėmis“. Kaip stabilumo kriterijus naudojamas mikobakterijų populiacijos augimo dydis maistinėje terpėje, kai preparato koncentracija yra kritinė.

Vidaus ftiziologijos praktikoje, nustatant atsparumą vaistams, neapsiribojama tik kritinių koncentracijų nustatymu. Taip yra dėl to, kad išplėstas patogeno atsparumo vaistams lygio apibrėžimas leidžia klinikiniam gydytojui, remiantis žiniomis apie vaistų derinių stiprinantį poveikį, tiksliau suformuluoti chemoterapijos taktiką, numatyti kryžminį atsparumą arba naudoti veiksmingesnius vaistus iš naudojamos vaistų nuo tuberkuliozės grupės.

Absoliučios koncentracijos metodas yra paprasčiausias, bet kartu ir jautriausias jį įgyvendinant padarytoms klaidoms. Patikimesnis, ypač nustatant jautrumą antros eilės vaistams, ir plačiai paplitęs už Rusijos ribų yra proporcijų metodas. Jis atsižvelgia į absoliučios koncentracijos metodo trūkumus, tačiau jo įgyvendinimas reikalauja daugiau darbo.

Šis metodas labai panašus į absoliučios koncentracijos metodą. Mėgintuvėliai su vaistais ruošiami taip pat, kaip ir taikant absoliučios koncentracijos metodą. Tačiau tuberkuliozės mikobakterijų suspensijos užkrėtimo dozė sumažinama 10 kartų, todėl sumažėja kai kurių tuberkuliozės mikobakterijų padermių savaiminio atsparumo tokiems vaistams kaip etambutolis, protionamidas, kapreomicinas, dažnis. Kontroliniais mėginiais naudojami 2 arba 3 mėgintuvėliai su užkrėtimo doze, lygia mėgintuvėliuose esančiai dozei, paeiliui praskiestų 10 ir 100 kartų. Atsparumo kriterijus yra vizualiai stebimo tuberkuliozės mikobakterijų augimo dalis. Pirmos eilės vaistams atsparumo kriterijus yra 1 % pradinės populiacijos perteklinis augimas, antros eilės vaistams – 1 % ar daugiau nei pradinės populiacijos augimas, priklausomai nuo pasirinktos kritinės koncentracijos.

1997 m. PSO ir Tarptautinės kovos su tuberkulioze sąjungos darbo grupė, tirianti atsparumą vaistams nuo tuberkuliozės, pakoregavo šiuos kriterijus, siūlydama laikyti atspariomis mikobakterijas, augančias tankioje Lowenstein-Jensen kiaušinėlių terpėje, esant šioms koncentracijoms:

• dihidrostreptomicinas - 4 μg/ml;
• izoniazidas – 0,2 µg/ml:
• rifampicinas – 40 mcg/ml:
• Etambutolis - 2 mcg/ml.

2001 m. buvo pasiūlytos kritinės koncentracijos šiems antros eilės vaistams (kritinei 1 % daliai):

• kapreomicinas - 40 mcg/ml;
• protionamidas - 40 mcg/ml;
• kanamicinas – 30 μg/ml;
• viomicinas – 30 μg/ml;
• cikloserinas - 40 mcg/ml;
• aminosalicilo rūgštis - 0,5 mcg/ml;
• ofloksacino – 2 mcg/ml.

Preliminarūs augimo rezultatai įvertinami po 4 savaičių, o galutiniai – po 6 savaičių auginimo.

Nustatant vaistų jautrumą pirazinamidui, kuris plačiai naudojamas šiuolaikinėje tuberkuliozės chemoterapijoje, rekomenduojama kritinė koncentracija yra 200 μg/ml. Tačiau vis dar nėra visuotinai pripažinto metodo, kaip nustatyti atsparumą šiam vaistui kietose mitybinėse terpėse, nes jo antibakterinis aktyvumas pasireiškia tik rūgštinėje aplinkoje (pH <6), kurią techniškai sunku palaikyti. Be to, daugelis klinikinių Mycobacterium tuberculosis kultūrų nenoriai auga kiaušinių terpėse su rūgštine aplinka.

Siekiant įvertinti mikobakterijų jautrumo vaistams nustatymo rezultatų kokybę, rekomenduojama kontroliuoti kiekvieną naują Lowenstein-Jensen terpės partiją, lygiagrečiai nustatant standartinės muziejinės H37Rv padermės jautrumą. Be to, yra tam tikrų mikrobiologinių kriterijų, kurių turi būti laikomasi, kad metodai duotų gerai atkartojamą ir teisingai interpretuojamą rezultatą. Tai apima tuberkuliozės mikobakterijų kultūros gyvybingumą, homogeninės suspensijos ir suspensijos gavimo taisykles, tuberkuliozės mikobakterijų kultūrų atrankos taisykles ir atrinktos bakterijų masės reprezentatyvumą. Atsparumo vaistams nustatymo patikimumas mažėja, kai bakterijų išsiskyrimas yra itin prastas.

Pastaruoju metu perspektyviu pripažintas vaistų jautrumo nustatymo metodas, naudojant automatizuotas sistemas. Pažangiausi šioje srityje yra VASTEC MGIT-960 pagrindu sukurti metodai. Šiuo atveju tuberkuliozės mikobakterijų jautrumas vaistams nustatomas modifikuotu proporcijų metodu. Nustatymo metu lyginamas tuberkuliozės mikobakterijų augimo greitis kontroliniame mėgintuvėlyje ir mėgintuvėliuose su vaistais. Jautrumui streptomicinui, izoniazidui, rifampicinui ir etambutoliui nustatyti naudojami praturtinantys priedai ir antibiotikai, esantys SIRE rinkinyje. Jautrumui pirazinamidui nustatyti naudojamas PZA rinkinys. Tyrimo metu mėgintuvėliai su vaistais inokuliuojami tuberkuliozės mikobakterijų suspensija, taip pat kontroliniai mėgintuvėliai su 100 kartų praskiedta suspensija visiems vaistams, išskyrus pirazinamidą, kur suspensijos praskiedimas yra 10 kartų. Stabilumo kriterijus yra 100 GU mikobakterijų augimo rodiklis, kai augimas kontroliniame mėgintuvėlyje pasiekia 400 GU (žr. „Mikobakterijų išskyrimo kultūriniai metodai“). Rezultatai įrašomi ir interpretuojami automatiškai, juos nustato įvesta arba pasirinkta programa.

Galutinės koncentracijos mėgintuvėlyje su skysta maitinamąja terpe naudojamos kaip kritinės koncentracijos. Šiuo metu kritinės koncentracijos yra sukurtos tiek pirmos eilės vaistams, tiek kai kuriems antros eilės vaistams. Reikėtų atkreipti dėmesį, kad tuberkuliozės mikobakterijų jautrumo cikloserinui ir aminosalicilo rūgščiai nustatymas atliekamas tik kiaušinių maitinamosiose terpėse.

Išsamus aprašytos sistemos darbo protokolas leidžia atlikti vaistų jautrumo tyrimus tiek izoliuotoje kultūroje (su tankia maistine terpe), tiek naudojant pirminį mikobakterijų augimą MGIT mėgintuvėlyje. Pastarasis variantas žymiai sutrumpina kultūrinių tyrimų atlikimo laiką, nes pilnus tuberkuliozės mikobakterijų kultūros rezultatus (įskaitant informaciją apie jautrumą vaistams) galima gauti per 3 savaites nuo medžiagos surinkimo, o tradicinis metodas tai gali padaryti tik po 3 mėnesio. Laiku gauti rezultatai, kai pacientas yra intensyvios gydymo fazės metu, gali kompensuoti santykinai didelę tyrimų kainą.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Mikobakterijų diferenciacija

Atsižvelgiant į tai, kad naudojamos maistinės terpės nėra griežtai selektyvios, vėlesnė izoliuotų mikobakterijų diferenciacija laikoma būtina. Mikobakterijų diferenciacijos poreikis atsiranda dėl daugelio genties atstovų sukeltų patologinių procesų ypatumų: skirtingos tuberkuliozės ir mikobakteriozės eigos ir baigties, natūralaus atsparumo kai kuriems vaistams nuo tuberkuliozės.

Pripažįstama, kad pirminis M. tuberculosis komplekso mikobakterijų identifikavimas nuo ne tuberkuliozinių mikobakterijų atliekamas pagal šias charakteristikas: augimo greitį tankioje maistinėje terpėje, pigmentų susidarymą, kolonijų morfologiją, atsparumą rūgštims ir optimalią augimo temperatūrą.

Deja, nėra vieno laboratorinio metodo, kuris galėtų patikimai atskirti M. tuberculosis komplekso mikobakterijas nuo kitų rūgštims atsparių mikobakterijų; tačiau aukščiau aprašytų požymių derinys su toliau pateiktų biocheminių tyrimų rezultatais leidžia identifikuoti M. tuberculosis komplekso mikobakterijas iki 95 % tikimybe.

Norint atskirti M. tuberculosis komplekso mikobakterijas (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii ir kitas) nuo lėtai augančių ne tuberkuliozinių mikobakterijų, naudojami pagrindiniai biocheminiai tyrimai, siekiant nustatyti šiuos požymius:

• gebėjimas gaminti nikotino rūgštį (niacino testas):
• nitratų reduktazės aktyvumas;
• termostabili katalazė;
• augimas terpėje su natrio salicilatu (1 mg/ml).

Kaip papildomas bandymas, taip pat galima atlikti augimo bandymus terpėje, kurioje yra 500 μg/ml para-nitrobenzenkarboksirūgšties arba 5 % natrio chlorido.

Daugelis bakteriologinių laboratorijų šiuos mikroorganizmus identifikuoja tik kompleksiniu lygmeniu, o tai lemia ribotos laboratorijų galimybės ir specialistų metodinės galimybės.

Praktiškai daugeliu atvejų M. tuberculosis ir M. bovis diferencijavimui pakanka šių tyrimų: niacino, nitratų reduktazės, pirazinamidazės ir augimo registravimo terpėje, kurioje yra 2 μg/ml tiofen-2-karboksirūgšties hidrazido. Atsižvelgiama į tai, kad M. tuberculosis komplekso mikobakterijoms būdingi šie požymiai:

• lėtas augimas (daugiau nei 3 savaitės);
• augimo temperatūra 35–37 ^° C ribose;
• pigmentacijos nebuvimas (dramblio kaulo spalva);
• ryški rūgštims atspari spalva;
• teigiamas niacino testas;
• teigiamas nitratų reduktazės testas;
• termostabilios katalazės nebuvimas (68 ^° C).
• augimo stoka Lowenstein-Jensen terpėje, kurioje yra:
  • 1000 µg/ml natrio salicilo rūgšties,
  • 500 mcg/ml para-nitrobenzenkarboksirūgšties,
  • 5 % natrio chlorido:
• augimas esant 1–5 μg/ml tiofen-2-karboksirūgšties.

Izoliuotų mikobakterijų diferenciacijos aktualumas gerokai išaugs didėjant su tuberkulioze ar mikobakterioze susijusių ŽIV/AIDS atvejų registracijos dažnumui. Šiuo metu nėra absoliutaus tikrumo dėl praktinių regioninių laboratorijų pasirengimo teisingai atlikti tokio masto darbą.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Imunologinė tuberkuliozės diagnostika

Yra daug universalių reiškinių, preparatų ir imunologinių testų, kurie iš pradžių buvo atrasti būtent tuberkuliozei arba imuninio atsako į mikobakterijas modelyje. Tai BCG ir tuberkulinas, toks reiškinys kaip odos DST (tuberkulino testai – Pirque ir Mantoux reakcijos), reakcija į poodinį tuberkulino skyrimą jautriems gyvūnams (Kocho reiškinys). Kai kurie pirmieji antikūnai, aptikti infekcinėse ligose, taip pat buvo atrasti tuberkulioze. Žinoma, kuo gilesnis antituberkuliozinio imuniteto mechanizmų ir jų genetinės kontrolės supratimas, tuo platesnis imunologinių metodų ir preparatų, turinčių įtakos imunitetui, naudojimas sprendžiant praktines ftiziologijos problemas.

Svarbiausia ir sudėtingiausia praktinė problema šiuo metu laikoma tuberkuliozės nustatymas atliekant masinį gyventojų patikrinimą. Tačiau, nepaisant daugybės „sėkmių“ pranešimų (remiantis ribota medžiaga), nėra jokio imunologinio metodo (atkartojamo „bet kuriose rankose“) ar vaisto, tinkamo šiems tikslams.

Klinikinėje praktikoje plačiai naudojami imunologiniai metodai, ypač serologiniai tyrimai (antigenų, antikūnų nustatymas) ir tuberkulino provokacijos testai.

Serologiniai metodai, kurie nustato antigenus ir antikūnus skirtingose kūno aplinkose, užima pirmąją vietą tarp imunologinių tyrimų, naudojamų diferencinėje diagnostikoje.

Antikūnų prieš mikobakterijų tuberkuliozę nustatymo specifiškumas priklauso nuo imuninėje analizėje naudojamų antigenų. Pasiūlyta nemažai antigenų, iš kurių pirmasis yra tuberkulino PPD:

• PPD ir kiti sudėtingi preparatai iš kultūros skysčio;
• ultragarsinis dezintegratorius;
• Tritono ekstraktas ir kiti sudėtingi ląstelių sienelių preparatai;
• 5-antigenas (Danielis);
• 60-antigenas (kokcitas);
• lipoarabinomananas;
• virkštelės faktorius (trehalozės-6,6-di-mikolatas);
• fenolio ir kiti glikolipidai;
• lipopolisacharidai;
• fibronektiną surišantis antigenas;
• baltymai (dažniausiai rekombinantiniai); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15, 12 KDA ir kt.

Ilgamečiai Rusijos ir užsienio mokslininkų tyrimai parodė pagrindinius antikūnų susidarymo modelius ir tuberkuliozės serologinės diagnostikos efektyvumą: kuo sudėtingesnis antigenas, tuo didesnis tyrimų jautrumas ir mažesnis specifiškumas. Specifiškumas skirtingose šalyse skiriasi priklausomai nuo populiacijos užsikrėtimo M. tuberculosis ir ne tuberkuliozinėmis mikobakterijomis, BCG vakcinacijos ir kt. Vaikams serodiagnostikos informatyvumas yra mažesnis nei suaugusiesiems. Sergant pirmine tuberkulioze (dažniau vaikams), informatyvesnis yra IgM nustatymas; antrine tuberkulioze – IgG. ŽIV infekuotiems asmenims serodiagnostikos informatyvumas nustatant antikūnus yra mažesnis. Antikūnų nustatymo efektyvumas priklauso nuo daugelio „klinikinių momentų“: proceso aktyvumo (mikobakterijų „izoliacijos“ buvimo ar nebuvimo, puvimo ertmių buvimo, infiltracijos laipsnio), proceso paplitimo, jo eigos trukmės.

Fermentinio imunofermentinio tyrimo (EIA) jautrumas yra apie 70 %. Nepakankamas tyrimo veiksmingumas atsiranda dėl mažo specifiškumo. Anksčiau buvo svarstomos serologinio patikrinimo galimybės didelės rizikos grupėse, ypač tarp žmonių, kuriems po tuberkuliozės atsirado plaučių pokyčių.

Siekiant padidinti ELISA specifiškumą, ieškoma specifiškesnių antigenų, įskaitant ir gautus genų inžinerijos būdu: ESAT-6 ir kt. (žr. aukščiau). Griežtai specifinių antigenų (38 kDa, ESAT) naudojimas padidina specifiškumą, tačiau žymiai sumažina analizės jautrumą. Kartu su ELISA (eksperimentinėmis laboratorinėmis tyrimų sistemomis, tokiomis kaip „Pathozyme ELISA“ rinkinys) taip pat siūlomi imunochromatografiniai rinkiniai su šonine filtracija („Mycodot“), taip pat kiti panašūs tyrimai (membraninių taškų analizė) su vizualiniu tyrimo rezultato įvertinimu. Atliekant šiuos tyrimus, analizė trunka 10–30 minučių; jiems nereikia specialios įrangos, reikia vizualiai įvertinti rezultatus, o tai siejama su tam tikru subjektyvumu. Šie metodai pasižymi maždaug tokiomis pačiomis jautrumo ir specifiškumo charakteristikomis (atitinkamai 70 % ir 90–93 %) kaip ir tradicinis ELISA.

Imuninės analizės metodų taikymas turi tam tikrą vertę kaip papildomas metodas, į kurį atsižvelgiama atliekant diferencinę tuberkuliozės diagnostiką, ypač diagnozuojant jos ekstrapulmonines formas. ELISA metodas yra veiksmingiausias diagnozuojant tuberkuliozinį meningitą, tiriant smegenų skystį. Šiuo atveju analizės jautrumas yra 80–85 %, o specifiškumas – 97–98 %. Yra informacijos apie antikūnų prieš Mycobacterium tuberculosis nustatymo ašarų skystyje efektyvumą diagnozuojant tuberkuliozinį uveitą.

Gama interferono sintezės indukcija in vitro

Gama interferonas (IFN-γ) yra specifinės imuninės apsaugos veiksnys, realizuojamas aktyvuojant makrofagų fermentų sistemas. IFN-γ sintezės indukciją jautriuose T limfocituose sukelia jų sąveika su mikobakterijų antigenais.

Kaip antigenai naudojami tiek tuberkulino PPD, tiek genetinės inžinerijos būdu gauti specifiniai antigenai, ypač ESAT-6 antigenas (ankstyvas sekretuojamas antigenas, kurio molekulinė masė yra 6 kDa) ir CFP-10 (kultūros filtrato baltymas, 10 kDa). Genetiškai modifikuotų arba rekombinantinių antigenų nėra BCG vakcinos ir kitų mikobakterijų ląstelėse. Naudojant tuberkuliną, IFN-γ indukcijos testo rezultatai yra palyginami su tuberkulino odos testo rezultatais (tiesioginė koreliacija). Naudojant genetiškai modifikuotus antigenus, testo rezultatai yra specifiškesni ir nepriklauso nuo ankstesnės BCG vakcinacijos. Tiriant vakcinuotus asmenis, kurie neturėjo kontakto su tuberkuliozės infekcija, testo specifiškumas yra 99 %. Testo jautrumas tarp tuberkulioze sergančių pacientų svyruoja nuo 81 iki 89 %.

Sukurti tyrimai ir diagnostika, pagrįsti trumpalaikiu viso kraujo ląstelių arba iš kraujo su tuberkuliozės mikobakterijų antigenais išskirtų mononuklearinių ląstelių kultivavimu in vitro, po kurio nustatoma IFN-γ koncentracija arba suskaičiuojamas IFN-γ sintetinančių T limfocitų skaičius. Mėgintuvėlyje susintetinto interferono koncentracija nustatoma ELISA metodu, naudojant IFN-γ jungiančius monokloninius antikūnus. Tada, naudojant standartinio IFN-γ kalibravimą, nustatoma jo koncentracija mėgintuvėlio arba plokštelės šulinėliuose.

Elispot teste ant lėkštelės, padengtos antikūnais prieš IFN-γ, suskaičiuojamas IFN-γ sintetinančių T ląstelių skaičius.

JAV Maisto ir vaistų administracijos patvirtinto in vitro IFN-γ indukcinės diagnostikos testo kūrėjai teigia, kad šis testas negali atskirti latentinės tuberkuliozės infekcijos nuo aktyvios tuberkuliozės. Todėl regionuose, kuriuose didelis užsikrėtimo lygis, šis testas neturi tiesioginės diagnostinės vertės. Tačiau mūsų šalyje jis gali būti naudojamas vaikų tuberkuliozės infekcijai atskirti nuo alergijos po vakcinacijos, taip pat specifinio imuniteto lygiui gydymo metu įvertinti.

Šiuo metu tiriama buitinė bandymų sistema, skirta nustatyti IFN-γ sintezės indukciją specifiniais tuberkuliozės antigenais in vitro.

Imuninė būklė ir tuberkuliozės eiga, imunokorekcija

Tuberkuliozės gydymo metu žmonėms pasikeičia antigenemija ir imuninės sistemos būklė.

Duomenys apie eksudatų ir audinių pokyčius yra labai prieštaringi. Vienintelis dalykas, kurį galima visiškai pagrįstai pastebėti, yra tai, kad tuberkuliozinėse granulomose paprastai yra daug aktyvuotų T limfocitų.

Prasminga aptarti dar du punktus, kurie yra būtini norint suprasti imunologinių mechanizmų vaidmenį gydant tuberkuliozę žmonėms:

• AIDS sergantiems pacientams ypač didelis daugelio vaistų atsparumo išsivystymo dažnis;
• Esant atsparumui keliems vaistams (ir nesant ŽIV infekcijos), imuniniai sutrikimai (pirmiausia T ląstelių imunitetas) yra ypač reikšmingi.

Tuberkuliozei plačiai taikomi įvairūs imunokorekcijos metodai: visų pirma, tai vaistai, kurie daugiausia veikia T ląstelių imunitetą ir mononuklearinę fagocitų sistemą (užkrūčio liaukos hormonus, izofoną, likopidą, polioksidonį ir kt.), taip pat sveikas (susilpnintas) mikobakterijas ir jų komponentus.

Tuberkuliozės molekulinė biologinė diagnostika

Molekulinės biologijos metodai infekcinių ligų diagnostikoje daugiausia apima metodus, pagrįstus bakterinių ir virusinių patogenų genominių medžiagų manipuliavimu, siekiant nustatyti specifinę genetinę medžiagą – DNR sekcijas su nukleotidų seka, būdinga tam tikrai patogeno rūšiai ar padermei, analizuoti specifines DNR sekas genuose, kurios lemia patogeno jautrumą tam tikriems vaistams, taip pat analizuoti tam tikrų patogeno genų funkcinį aktyvumą. Molekulinės biologijos metodai tapo plačiai paplitę moksliniuose tyrimuose ir praktiškai pritaikomi įvairių bakterinių ir virusinių infekcijų diagnostikoje ir stebėjime po to, kai 1985 m. Carrie Mullis (Nobelio premijos laureatė, 1989 m.) atrado polimerazės grandininę reakciją.

Polimerazės grandininės reakcijos metodo principai ir galimybės

PGR leidžia per kelias valandas milijonus kartų amplifikuoti (dauginti) nukleotidų seką (patogeno DNR fragmentą) mėgintuvėlyje. Reakcijos atlikimas esant pavienėms DNR grandinėms lemia itin didelį analizės jautrumą.

Tam tikrų DNR grandinės sekcijų nukleotidų seka lemia mikroorganizmo genetinį unikalumą, o tai paaiškina didelį PGR specifiškumą.

Šio metodo svarba nustatant ir tiriant Mycobacterium tuberculosis savybes priklauso nuo mikroorganizmo biologinių savybių, kurios auga labai lėtai: Mycobacterium tuberculosis DNR dvigubėjimo laikas jų kultivavimo metu yra 12–24 valandos.

PGR metodo principas yra amplifikacija – daugkartinis, milijonus kartų trunkantis specifinės DNR sekos sekcijų dauginimas mėgintuvėlio mikrotūryje, cikliškai kartojant šiuos tris reakcijos etapus, kurių kiekvienas vyksta skirtingu temperatūros režimu:

• I etapas - dvigrandės DNR denatūracija kaitinant, kai jos grandinės išsisklaido;
• II etapas - pradmenų (pradinių oligonukleotidų) komplementarinis surišimas (hibridizacija) su griežtai specifinio DNR fragmento, pasirinkto amplifikacijai, grandinių galinėmis dalimis;
• III etapas – DNR fragmento grandinės užbaigimas naudojant termostabilią DNR polimerazę.

Amplifikacijai mėgintuvėlyje turi būti matricinės DNR molekulės. Keturių tipų deoksinukleozidų trifosfatai (nukleotidai), turintys atitinkamas azoto bazes: adeniną (A), timiną (T), guaniną (G), citoziną (C); dirbtinai susintetinti pradmenų oligonukleotidai (pradmenys), sudaryti iš 18–20 bazių porų; termostabilus fermentas DNR polimerazė, kurios temperatūros optimumas yra 68–72 ^° C, ir magnio jonai.

PGR specifiškumas priklauso nuo DNR fragmento pasirinkimo. Pagal jį sintetinami flankingi pradmenų oligonukleotidai. Hibridizacijos ir DNR grandinės užbaigimo specifiškumą lemia šių azoto bazių porų: adenino-timino, guanino-citozino, komplementarumo principas.

Norint nustatyti tuberkuliozės komplekso mikobakterijų genomą, daugumoje tyrimų sistemų efektyviausias amplifikacijos taikinys yra IS6110 DNR fragmentas, kuris daugumoje tuberkuliozės mikobakterijų padermių turi reikšmingą skaičių (10–20) pasikartojimų genome, o tai užtikrina ne tik specifiškumą, bet ir didelį analizės jautrumą. Tuo pačiu metu aprašytos tuberkuliozės mikobakterijų padermės su nedideliu pasikartojimų skaičiumi arba be IS6110 fragmento.

DNR molekulių išskyrimas iš biologinio mėginio

Norint atlikti PGR, patogeno DNR molekulės turi būti išskirtos iš biologinės medžiagos minimaliu tūriu, su minimaliu nespecifinės DNR kiekiu ir įvairiais fermento - DNR polimerazės - inhibitoriais.

Mėginių paruošimas turi būti atliekamas tokiomis sąlygomis, kurios užkirstų kelią tiriamų mėginių kryžminiam užteršimui izoliuotomis DNR molekulėmis. Tam reikia iš anksto apdoroti patalpą ultravioletiniais spinduliais, grindis ir stalų bei prietaisų darbo paviršius chloro turinčiais tirpalais. Taip pat būtina naudoti švarias pirštines, vienkartinius mėgintuvėlius ir automatinių pipečių antgalius.

Norint išskirti Mycobacterium tuberculosis DNR iš klinikinių mėginių (smegenų skysčio, bronchų lavažo), kuriuose nėra daug leukocitų, ląstelių nuosėdų ar druskų, pakanka centrifuguoti mėginį 3–4 tūkst. apsisukimų per minutę greičiu, į nuosėdas įpilti 20–30 µl 2 % Triton X-100 tirpalo ir 30 minučių kaitinti 90 ^{° C temperatūroje.}

Skreplių mėginio paruošimui reikalingas efektyvus suskystinimas, paprastai naudojant 4 % natrio hidroksido ir N-acetil-L-cisteino (NALC), kurių kiekis yra 50–80 mg vienam mėginiui, priklausomai nuo mėginio klampumo. NALC tirpalas turi būti ruošiamas iš anksto arba NALC milteliai gali būti įberiami sausų tiesiai į mėginį. Po suskystinimo mėginiai turi būti centrifuguojami 15 min. 3 500–4 000 aps./min. (3 000 g) 50 ml mėgintuvėliuose su užsukamais dangteliais, t. y. tomis pačiomis sąlygomis, kurios rekomenduojamos skreplių paruošimui prieš kultivavimą.

DNR išskyrimui iš nuosėdų dažniausiai naudojamas metodas, pagrįstas 5–6 molių guanidino izotiocianato tirpalo, kaip lizinio reagento, ir mikroporingų silicio oksido dalelių („diatomito“), kurios sorbuoja DNR molekules, naudojimu. Nespecifinės medžiagos, įskaitant galimus inhibitorius, vėliau plaunamos 2,5 molio guanidino izotiocianato tirpale ir etanolio tirpale, po to DNR molekulės desorbuojamos vandenyje, o šie mėginiai naudojami PGR atlikti. Siekiant supaprastinti DNR išskyrimo technologiją, „diatomitas“ dažnai pakeičiamas magnetinėmis mikrodalelėmis, padengtomis silicio oksidu. Šiuo atveju dalelėms nusodinti naudojamas specialus magnetinis mikromėgintuvėlių stovas, o ne centrifugavimas.

Rusijoje sukurtas originalus imunomagnetinio mikobakterijų atskyrimo metodas su vėlesne patogeno DNR ekstrakcija. Tuberkuliozės mikobakterijų imunomagnetiniam atskyrimui naudojamos 3–5 μm dydžio ferodalelės, padengtos silicio oksidu, prie kurių cheminiu ryšiu prijungiami polikloniniai (triušio) antikūnai prieš tuberkuliozės mikobakterijas. Skreplių mėginiai po šarminės lizės neutralizuojami rūgštiniu Tris-HCl tirpalu ir inkubuojami su imunomagnetiniu sorbentu. Tada imunoferodalelės surenkamos magnetine lazdele su keičiamu antgaliu, perkeliamos į mikromėgintuvėlį ir nusodinamos. Įpilama 20–30 μl 2 % Triton X-100 tirpalo ir 30 minučių kaitinama 90 ^° C temperatūroje. Supernatantas naudojamas kaip DNR matrica PGR analizei.

Sudėtinga problema yra tuberkuliozės mikobakterijų DNR išskyrimas iš biopsijos mėginių. Biopsijos lizei naudojamas fermentas proteinazė K, kurio galutinė koncentracija yra 200–500 mg/l, 56 ^° C temperatūroje per naktį. Tada ji ekstrahuojama vienu iš žinomų metodų. Nespecifinės DNR perteklius PGR analizėje biopsijos mėginiuose dažnai sukelia reakcijos slopinimą, todėl reikia pakartoti DNR ekstrakciją.

Rezultatų aptikimo metodai

Pasibaigus reakcijai, amplifikuoti patogeno DNR fragmentai identifikuojami naudojant įvairius metodus.

Gelio elektroforezės metodas yra gerai žinomas. Šiuo atveju gautas DNR fragmentas identifikuojamas pagal teigiamą kontrolę, kurioje yra norimas specifinis DNR fragmentas, arba pagal iš anksto žinomą fragmento dydį (nukleotidų porų skaičių), kuris nustatomas naudojant standartinį molekulinį žymeklį.

Esant specifiniam dažikliui - etidio bromidui, kuris yra dvigrandės DNR dalis, susintetintas DNR fragmentas išryškėja kaip juostelė, kuri švyti ultravioletinių spindulių įtakoje.

DNR fragmento dydis, nustatytas elektroforezės būdu pagal nuo pradžios nueitą atstumą, turi atitikti žinomą molekulinės masės žymeklį arba teigiamą kontrolę.

Kiti PGR rezultatų nustatymo metodai yra pagrįsti viengrandžių PGR produktų hibridizacija su komplementariu oligonukleotidu – DNR zondu, pažymėtu biotinu, po kurio seka aptikimas naudojant fermentinę reakciją, pavyzdžiui, prisijungiant streptavidino ir šarminės fosfatazės konjugatą prie biotino.

Remiantis šiuo aptikimo tipu, buvo sukurti PGR analizatoriai, kuriuose PGR rezultatai nustatomi automatiškai, nuskaitant mėginių optinį tankį po fermentinės reakcijos.

Šių metodų trūkumai yra laboratorijos viduje užteršimo galimybė gana trumpais DNR molekulių fragmentais. Kai šios molekulės patenka į naujai tirtus mėginius, jos tampa PGR matrica ir lemia klaidingai teigiamus rezultatus.

Šiuo atžvilgiu, siekiant išvengti klaidingai teigiamų rezultatų, įvedamos griežtos taisyklės, kaip atskirti ir izoliuoti patalpas: DNR išskyrimui iš biologinių mėginių; patalpas, skirtas rezultatų aptikimui (elektroforezei) nuo švariosios zonos. Šios patalpos yra galimo užterštumo zona. Kita izoliuota zona yra švari patalpa, skirta tiriamiems DNR mėginiams įdėti į mėgintuvėlius su reakcijos mišiniu PGR. Galiausiai daroma prielaida, kad pagrindinis įrenginys – DNR stiprintuvas – turėtų būti išneštas į atskirą, galbūt biuro, patalpą.

Siekiant išvengti užteršimo ankstesnių reakcijų produktais – amplikonais, kai kuriose PGR tyrimų sistemose vietoj deoksinukleozido timidino, kuris in vitro grandinės sintezės metu yra įkomponuojamas atitinkamoje padėtyje, yra deoksinukleozido uridino, t. y. azoto bazė timinas, esantis natūralioje DNR, pakeičiamas uracilu. Į analizuojamos medžiagos reakcijos mišinį įpilta uracilo DNR glikozilazė sunaikina tik deoksiuridinu užterštus fragmentus, bet ne natūralią analizuojamą DNR, kurioje yra deoksitimidino. Vėlesnis kaitinimas 94 ^° C temperatūroje inaktyvuoja šį fermentą ir netrukdo amplifikacijai PGR metu.

Yra tyrimų sistema, pagrįsta rRNR izoterminiu amplifikavimu, kuriam pirmiausia atliekama atvirkštinė DNR molekulių transkripcija ir sintezė, kurios savo ruožtu yra matrica vėlesnei RNR molekulių sintezei. RNR amplikonai aptinkami naudojant akridinu dažytą DNR zondą hibridizacijos metu reakcijos mėgintuvėlio tirpale. Šis metodas, be didelio jautrumo, turi pranašumą, kad analizė atliekama viename mėgintuvėlyje, o tai apsaugo nuo užteršimo. Pasak autorių, šio metodo jautrumas kvėpavimo takų mėginiuose siekia 90 %, o specifiškumas – 99–100 %.

Realaus laiko PGR diegiami nauji aptikimo metodai. Šie metodai skiriasi pirmiausia tuo, kad PGR ir jos rezultatų aptikimas atliekami vienu metu viename uždarame mėgintuvėlyje. Tai ne tik technologiškai supaprastina analizės metodą, bet ir apsaugo laboratorijos patalpas bei mėginius nuo užteršimo ankstesnės PGR produktais.

Realaus laiko PGR metu rezultatai nustatomi pagal fluorescenciją, atsirandančią hibridizuojant fluorogeninį DNR zondą su specifiniu DNR fragmentu, amplifikuotu PGR metu. Fluorogeninių DNR zondų struktūra yra sukonstruota taip, kad fluorescencinis žymuo išsiskiria dėl fermentinės reakcijos arba atsiriboja nuo fluorescenciją slopinančios molekulės tik po specifinės hibridizacijos su norima DNR molekule, amplifikuota PGR metu. Didėjant su zondu hibridizuotų molekulių skaičiui, fluorescencijos padidėjimas iki aptinkamo lygio yra proporcingas amplifikuoto produkto molekulių skaičiui. Kadangi DNR fragmentų molekulių skaičius padvigubėja kiekvieno PGR ciklo metu, ciklo numeris, nuo kurio nustatoma ir didėja fluorescencija, yra atvirkščiai proporcingas DNR molekulių skaičiui pradiniame mėginyje. Jei į reakciją kaip kalibratorius įvedamos kelios skirtingos žinomos atitinkamo tuberkuliozės mikobakterijų DNR fragmento molekulių koncentracijos, DNR genomų skaičių tiriamoje medžiagoje galima apskaičiuoti naudojant kompiuterinę programą.

Kiekvienas standartinis mėginys yra dubliuojamas. Kiekybinis kriterijus yra minimalus PGR ciklų skaičius, reikalingas aptinkamos fluorescencijos pradžiai ir augimui. Abscisės ašis yra ciklų skaičius; ordinatės ašis yra fluorescencijos vertė. DNR koncentracijos yra atvirkščiai proporcingos ciklų skaičiui, reikalingam fluorescencijai atsirasti. Dešiniojo stulpelio langai (21–32) rodo atitinkamų koncentracijų ciklų numerius. Skirtumas tarp 10 kartų didesnių DNR fragmentų koncentracijų 10² ^– 10³ ^ml yra 3,2–3,4 ciklo. Dviem pacientams IS6110 fragmentų koncentracijos buvo apie 10³ ^/ ml ir 10³ ^/ ml. Atsižvelgiant į analizuojamų fragmentų pasikartojimų skaičių (6–20) Mycobacterium tuberculosis genome, Mycobacterium tuberculosis skaičius klinikiniuose mėginiuose yra atitinkamai apie 100 ir 1000 ląstelių.

PGR taikymas diagnozuojant tuberkuliozę

PGR metodas plačiausiai naudojamas greitai tuberkuliozės diagnostikai – Mycobacterium tuberculosis nustatymui klinikiniuose mėginiuose: skrepliuose, bronchų išplovimo skystyje, pleuros eksudate, šlapime, smegenų skystyje, osteolizės punkcijose, moters lytinių takų aspiratuose ir įvairiose biopsijose. Olandijoje atliktame tyrime, kuriame buvo ištirta apie 500 skreplių ir bronchų išplovimo mėginių iš 340 pacientų, kuriems patvirtinta plaučių tuberkuliozės diagnozė, buvo tirtas PGR, pasėlio ir tepinėlio mikroskopijos metodų lyginamasis jautrumas. Analizės jautrumas buvo atitinkamai 92,6, 88,9 ir 52,4 %. Visų metodų specifiškumas buvo apie 99 %.

Buvo palygintas Mycobacterium tuberculosis aptikimo efektyvumas naudojant tepinėlio mikroskopiją, sėją ant Lowenstein-Jensen terpės, VASTES testo sistemą ir PGR analizę. PGR jautrumas buvo 74,4 %, mikroskopija – 33,8 %, sėja ant kietos terpės – 48,9 %, o VASTES – 55,8 %. Vidutinis aptikimo laikas sėjant ant Lowenstein-Jensen terpės yra 24 dienos, VASTES – 13 dienų, PGR – 1 diena.

Taip pat aptariamas PGR, kaip jautraus ir greito tuberkuliozės gydymo veiksmingumo stebėjimo metodo, potencialas.

Mycobacterium tuberculosis DNR nustatymas PGR metodu taikant veiksmingą chemoterapiją nustatomas per ilgesnį laiką – vidutiniškai 1,7 mėnesio, palyginti su bakterijų išskyrimu, nustatytu fluorescencine mikroskopija, ir 2,5 mėnesio, palyginti su bakteriologiniu tyrimu.

Ekstrapulmoninių tuberkuliozės formų diagnozė

PGR, kaip jautraus metodo, svarba yra ypač didelė ekstrapulmoninėms formoms, nes būtent šiomis formomis klinikiniai ir radiologiniai metodai bei tradiciniai bakteriologiniai metodai Mycobacterium tuberculosis nustatymui diagnostinėse medžiagose yra neefektyvūs.

Tiriant šlapimo mėginius, PGR analizės rezultatai buvo teigiami 16 iš 17 pacientų, sergančių aktyvia šlapimo sistemos tuberkulioze, ir neigiami 4 pacientams, sergantiems neaktyvia inkstų tuberkulioze, ir 39 pacientams, sergantiems ne tuberkuliozinėmis šlapimo sistemos ligomis.

Buvo įrodytas PGR analizės efektyvumas tiriant kaulų čiulpų aspiratus pacientams, sergantiems nežinomos genezės karščiavimu ir įtariama tuberkuliozinė liga. Vaikų tuberkuliozinio limfadenito diagnozei buvo ištirti 102 punkcijos aspiratai ir biopsijos mėginiai iš 67 vaikų, įtariamų tuberkulioziniu limfadenitu. Teigiami rezultatai gauti: realaus laiko PGR - 71,6 %, fluorescencinės mikroskopijos - 46,3 %, kultūros tyrimo - 41,8 %. Tiriant 50 limfmazgių biopsijų pacientams, sergantiems katės įbrėžimo liga, visi rezultatai buvo neigiami. Taigi, buvo įrodytas 100 % PGR analizės specifiškumas. Tame pačiame darbe buvo parodyta galimybė aptikti M. avium atliekant punkcijos limfmazgių biopsiją.

Moterų lytinių organų tuberkuliozės diagnostika nevaisingumo atvejais yra viena sunkiausių diagnostinių problemų. Teigiami PGR tyrimų rezultatai gauti atlikus endometriumo biopsijas, endometriumo aspiratus ir Douglaso maišelio skysčio mėginius 14 (56 %) iš 25 pacienčių, kurioms buvo įtariama tuberkuliozė laparoskopiškai. Tepinėlio mikroskopija ir pasėlio tyrimai davė atitinkamai 1 ir 2 teigiamus rezultatus. Šie atvejai taip pat buvo teigiami PGR tyrimo metu. Dauguma teigiamų PGR rezultatų gauti tais atvejais, kai histologiniu tyrimu buvo nustatyti būdingi tuberkuliozės požymiai; mažesnis skaičius – tais atvejais, kai laparoskopiniu tyrimu buvo įtariama tuberkuliozė. Tik vienas teigiamas PGR rezultatas gautas nesant laparoskopinių tuberkuliozės duomenų.

Diagnozuojant ekstrapulmonines tuberkuliozės formas, gydytojams dažnai kyla klausimas dėl patogeno identifikavimo galimybės tiriant kraujo mėginius PGR metodu. Literatūros duomenys rodo, kad Mycobacterium tuberculosis DNR nustatymas iš kraujo mėginių yra įmanomas esant pažengusioms ŽIV infekcijos formoms. Mycobacterium tuberculosis DNR buvo aptikta tik esant generalizuotai įvairių organų tuberkuliozei pacientams, kuriems buvo persodintas inkstas ir imunosupresija.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Mikobakterijų rūšių identifikavimas

PGR metodas gali būti gana efektyvus greitam tuberkuliozės komplekso mikobakterijų ir kai kurių ne tuberkuliozės mikobakterijų tipų identifikavimui po pirminio jų augimo. Šiuo atveju PGR naudojimas gali sutaupyti 7–10 dienų, reikalingų vėlesniam teigiamo rezultato kultūriniam identifikavimui. PGR tyrimas yra techniškai labai paprastas, nes jam nereikia sudėtingo klinikinės medžiagos mėginio paruošimo, kad būtų pasiektas didelis jautrumas. Tiriant 80 teigiamų kultūrų tokioje tyrimų sistemoje (MB BacT. by Organon), visi teigiami PGR analizės rezultatai buvo griežtai specifiniai ir atlikti per 1 dieną. Norint identifikuoti kitų tipų mikobakterijas, gautas kultūroje, patogeno DNR hibridizuojama su specifiniais DNR zondais, pažymėtais akridinu, o padermės aptinkamos pagal chemiluminescenciją naudojant chemiluminometrą arba ant nitroceliuliozės juostelių, vizualiai įvertinant po hibridizacijos. Šis rinkinys identifikuoja ribotą rūšių skaičių: Mycobacterium tuberculosis kompleksą, M. avium, M. avium kompleksą, M. kansasii ir M. gordonae.

A. Telenti ir kt. taip pat sukūrė gana paprastą ir nebrangų kliniškai svarbių mikobakterijų rūšių identifikavimo metodą, pagrįstą PGR ir vėlesniu apdorojimu dviem restrikcijos fermentais (fermentais, kurie gali perpjauti DNR molekulę tam tikrose vietose). Šiuo atveju amplifikuojamas DNR fragmentas, koduojantis šilumos šoko baltymą (65 kDa), po kurio PGR gautas DNR fragmentas, kurio dydis 439 nukleotidų poros, atskirai apdorojamas dviem fermentais – Bste II ir Нае III. Tada, naudojant agarozės gelio elektroforezę, analizuojami du gauti produktai, nustatant jų dydžius (nukleotidų porų skaičių) naudojant standartinių DNR fragmentų (molekulinių DNR žymenų) rinkinį, kurio ilgis yra nuo 100 iki 1000 nukleotidų porų. Kiekvienoje iš apibrėžtų rūšių (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. fortuitum) kiekvienam restrikcijos fermentui randami 2 arba 3 skirtingo dydžio DNR fragmentai. Gautų skirtingo dydžio DNR fragmentų derinys leidžia šias rūšis atskirti vieną nuo kitos.

Kuriama biologinių DNR mikrogardelių technologija, kuri padės vieno tyrimo metu identifikuoti daugiau nei 100 mikobakterijų rūšių.

Rūšių identifikavimas taip pat gali būti atliekamas naudojant 16S rRNR kintamojo regiono PGR amplifikaciją, po kurios seka amplikonų sekvenavimas, lyginant su atitinkama pirmine struktūra, kas leidžia identifikuoti daugiau nei 40 mikobakterijų rūšių.

PGR taip pat gali būti naudojama tuberkuliozės mikobakterijų komplekso rūšims identifikuoti, įskaitant diferenciaciją tarp M. bovis ir M. bovis BCG. Tai atliekama analizuojant tam tikrų genų buvimą arba nebuvimą genomo regionuose RD1, RD9 ir RD10. RD1 nėra M. bovis BCG, bet yra virulentiškose rūšyse, įskaitant M. bovis.

Mycobacterium tuberculosis jautrumo vaistams nustatymas PGR metodu

Molekulinės genetinės diagnostikos metodų, skirtų nustatyti Mycobacterium tuberculosis jautrumą vaistams arba atsparumą jiems, užduotys yra sumažintos iki žinomų genų tam tikrų nukleotidų sekų mutacijų nustatymo. Pagrindiniai metodai yra pagrįsti arba tiesioginiu šių sekų nuskaitymu (sekvenavimu) po amplifikacijos, arba biotinu žymėtų DNR fragmentų, amplifikuotų PGR metu, hibridizacija su DNR zondais. Abu variantai apima nukleotidų sekų pakeitimų, kurie, naudojant DNR zondus, lemia hibridizacijos nebuvimą arba nepilną įvykį nitroceliuliozės membranoje, naudojant fermento konjugatą (streptavidino-šarminės fosfatazės) – LIPA-Rif-TB metodą, identifikavimą.

Fluorescencijos matavimo lokaliai fiksuotuose DNR zonduose mikroregionuose, komplementariuose žinomoms mutacijoms PGR amplifikuotuose genų regionuose, atsakinguose už jautrumą vaistams arba atsparumą jiems, metodas vadinamas mikrobiolustų metodu. Pagrindinis šio tyrimo algoritmas yra toks. Išskyrus DNR iš klinikinio mėginio arba mikobakterijų kultūros, reikia atlikti PGR, kad būtų amplifikuoti atitinkami groB geno, atsakingo už jautrumą vaistams rifampicinui, fragmentai arba katG ir inhA genai, koduojantys mikobakterijų baltymus, atsakingus už jautrumą izoniazidui. PGR rezultatai įvertinami naudojant agarozės gelio elektroforezę, kuri patvirtina atitinkamų norimo ilgio DNR fragmentų gavimą. Tada atliekamas antras PGR etapas, siekiant į DNR įvesti fluorescencinę žymę. PGR rezultatai dar kartą patvirtinami gelio elektroforeze. Po to atliekama hibridizacija (inkubacija per naktį), o gauta medžiaga plaunama ant biolusto, kuris yra didelis skaičius trumpų DNR grandinių (zondų), pritvirtintų ant mažos stiklinės plokštelės, komplementarių vaistams jautrių tuberkuliozės mikobakterijų tipo nukleotidų sekoms galimų mutacijų vietose. taip pat mutantų sekoms, atsakingoms už atsparumą vaistams. DNR zondų vieta plokštelėje yra griežtai apibrėžta, o hibridizacijos metu stebimas fluorescencijos lygis, siekiant nustatyti rezultatą naudojant specialų skaitymo įrenginį, nustatomas. Šiuo atžvilgiu analizės rezultatai nustatomi naudojant specialią kompiuterinę programą.

Pastaraisiais metais, pagrįsti realaus laiko PGR technologija, buvo sukurti alternatyvūs Mycobacterium tuberculosis jautrumo vaistams nustatymo metodai, leidžiantys šiuos tyrimus atlikti uždaro mėgintuvėlio režimu.

13-13 paveiksle pateikti klinikinių Mycobacterium tuberculosis kultūrų analizės, siekiant nustatyti atsparumą rifampicinui naudojant realaus laiko PGR, rezultatai: 218 – kontrolinis mėginys (jautrus rifampicinui); 93 – teigiama kontrolė Ser-Trp TCG-TGG mutacijai; 4482 – teigiama kontrolė Ser-Leu TCG-TTG mutacijai; 162–322 – eksperimentiniai mėginiai. 4 kanalų amplifikacijos kinetinių kreivių apskaičiavimo rezultatas: 1 kanalas: 393 – teigiama kontrolė Ser-Trp TCG-TGG mutacijai; 2 kanalas: 4482 – teigiama kontrolė Ser-Leu TCG-TTG mutacijai; 162, 163, 172, 295 – eksperimentiniai mėginiai; 4 kanalas: visų eksperimente dalyvavusių mėginių amplifikacijos kinetinės kreivės. Teigiama amplifikacijos reakcijos kontrolė. Išvados: Analizė atskleidė šias mutacijas, lemiančias atsparumą rifampicinui: 162, 163, 172, 295 mėginiuose - Ser-Leu TCG-TTG. Tuo pačiu principu buvo nustatytas atsparumas izoniazidui, naudojant katG ir inhA genus, kurie lemia dažniausias mutacijas.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Mycobacterium tuberculosis padermės identifikavimas

Labiausiai ištirtas Mycobacterium tuberculosis padermės identifikavimo metodas yra technologija, vadinama restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmu (RFLP), kuri pagrįsta Mycobacterium tuberculosis DNR fragmentacija (restrikcija) fermentu Pvu II ir vėlesne gautų fragmentų hibridizacija su tam tikromis specifinėmis sekomis jos pasikartojančio elemento IS6110 DNR. Vidurūšinis kintamumas atsiranda dėl skirtingo IS6110 pasikartojimų skaičiaus ir jų vietos DNR, taip pat dėl atstumo tarp tam tikrų restrikcijos fermento atakos taškų (restrikcijos vietų) ir IS6110 elemento įvairovės. Ši technologija yra labai sudėtinga ir reikalaujanti daug darbo. Apdorojus iš tuberkuliozės mikobakterijų kultūros išskirtą DNR restrikcijos fermentu, atliekama gelio elektroforezė, tada skirtingo ilgio DNR fragmentai perkeliami ant nitroceliuliozės membranos, hibridizuojami su IS6110 elemento fragmentais, o rezultatai nustatomi naudojant fermentinę reakciją. Gautas specifinis juostų modelis apibūdina specifinės tuberkuliozės mikobakterijų padermės DNR. Kompiuterinė analizė atskleidžia padermių tapatybę arba giminingumą. Nepaisant to, kad RFLP metodas yra labiausiai diskriminuojantis, t. y. jis atskleidžia daugiausiai skirtumų analizuojamose padermėse, jis yra neveiksmingas esant nedideliam IS6110 pasikartojimų skaičiui (mažiau nei 5), pastebėtam kai kuriose padermėse. 13–14 paveiksluose pateikti padermių RFLP tipizavimo rezultatai.

Alternatyva gali būti spoligotipizavimo metodas – tarpinių DNR sekų polimorfizmo analizė – tarpinė vieta tarp tiesioginių DR regiono pasikartojimų. Atliekant padermių spoligotipizavimą, PGR atliekama su DR regioną ribojančiais pradmenimis, po to susidaro skirtingo ilgio fragmentai, kurie hibridizuojasi su kintamais tarpiniais DNR regionais. DR regiono tarpinių sekų analizė, anot tyrėjų, atrodo paprastesnė, produktyvesnė ir tinkamesnė pirminiam padermių patikrinimui ir preliminariai epidemiologinei analizei, taip pat tiesiogiai tiriant klinikinę medžiagą.

Akivaizdu, kad efektyvesnis ir technologiškai prieinamesnis metodas yra VNTR (angliškų žodžių santrumpa), arba metodas, kuriuo nustatomas kintamas tikslių tandeminių pasikartojimų skaičius tuberkuliozės mikobakterijų DNR. Šis metodas pagrįstas tik PGR naudojimu ir nereikalauja papildomų manipuliacijų. Kadangi tandeminių pasikartojimų skaičius skirtingose padermėse ir skirtinguose lokusuose yra skirtingas, skirtingo dydžio fragmentai nustatomi ir analizuojami gautoje PGR produktų elektroforegramoje. Pasak tyrėjų, naudojant VNTR pasiekiamas didesnis padermių atskyrimo laipsnis nei naudojant RFLP metodą.

Pastaraisiais metais daug dėmesio skirta W-Beijing šeimos Mycobacterium tuberculosis padermių (kartais vadinamų Pekino paderme), kurios daugiausia yra atsparios vaistams, plitimui.

Pagrindiniai molekulinės biologijos tyrimų kokybės reikalavimai

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Pagrindiniai PGR atlikimo norminiai dokumentai

Rusijos Federacijos Sveikatos ministerijos įsakymai: Nr. 45, 2000-02-07; Nr. 109, 2003-03-21; Nr. 64, 2000-02-21. Gairės: 1.3.1888-04 „Darbo organizavimas atliekant III-IV patogeniškumo grupių patogeniniais biologiniais agentais užkrėstos medžiagos PGR tyrimus“; 1.3.1794-03 „Darbo organizavimas atliekant I-II patogeniškumo grupių mikroorganizmais užkrėstos medžiagos PGR tyrimus“. 2003; 3.5.5.1034-01 „I-IV patogeniškumo grupių bakterijomis užkrėstos tiriamosios medžiagos dezinfekavimas dirbant PGR metodu“, 2001. Instrukcijos dėl vieningų mikrobiologinių tyrimų metodų tuberkuliozei nustatyti, diagnozuoti ir gydyti 11 priedas.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Personalas

Molekulinės biologijos tyrimus gali atlikti klinikinės laboratorinės diagnostikos gydytojai, bakteriologai, virologai, klinikinės diagnostikos laboratorijos biologai, taip pat specialistai, turintys vidurinį medicininį išsilavinimą, baigę specializaciją ir kvalifikacijos kėlimą nustatyta tvarka.

Laboratorinių patalpų išdėstymas

Reikalingos šios laboratorinės įrangos:

• Mėginių apdorojimo zona – laboratorija, pritaikyta darbui su III–IV patogeniškumo grupių infekciniais agentais, pagal Metodologines gaires 13.1888-04.
• PGR reakcijos mišinių ruošimo vieta yra laboratorijos patalpa, apsauganti nuo vidinės laboratorijos taršos – „švari“ zona.
• • Jei PGR produktams analizuoti naudojama elektroforezė arba hibridizacija, laboratorijos patalpa, kurioje amplifikuoti DNR fragmentai yra išskiriami iš amplifikacijos mėgintuvėlio ir atitinkamai gali patekti į aplinką, laikantis PGR laboratorijoms keliamų reikalavimų (Metodinės gairės 1.3.1794-03, Metodinės gairės 1.3.1888-04), turi būti visiškai izoliuota nuo ankstesnėse pastraipose nurodytų patalpų. Turi būti užkirstas kelias bet kokio personalo, įrangos, medžiagų ir daiktų judėjimui iš elektroforezės zonos į mėginių apdorojimo zoną ir „švarią“ zoną, taip pat oro pernašai per vėdinimo sistemą arba dėl skersvėjų. Ši zona nebūtina PGR produktų fluorimetriniam nustatymui.
• Dokumentavimo ir rezultatų apdorojimo patalpa aprūpinta kompiuteriais ir reikalinga biuro įranga. Šioje patalpoje gali būti įranga, užtikrinanti PGR produktų aptikimą neatidarant mėgintuvėlio. - fluorescenciniai PGR detektoriai ir termocikleriai realaus laiko PGR.

Sanitariniai ir epidemiologiniai reikalavimai pirminiam skreplių apdorojimui yra panašūs į standartinius mikrobiologinius reikalavimus dirbant su Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Pilnas laboratorinės įrangos rinkinys PGR diagnostikai

Laboratoriniame rinkinyje yra įranga šioms patalpoms.

• Mėginių paruošimo patalpa, kurioje yra ši įranga: II apsaugos klasės „SP-1.2“ laminarinio srauto gaubtas: kietojo kūno termostatas su šildomu dangčiu Eppendorf mėgintuvėliams; mikrocentrifuga, veikianti 13 000 aps./min. greičiu; centrifuga („Vortex“); šaldytuvas, kurio temperatūros diapazonas yra nuo -20 ^° C iki +10 ^° C; kintamo tūrio „Proline“ serijos pipetės; siurblys su gaudykle OM-1; pipečių stovas; darbo vietos stovas 200x0,5 ml; darbo vietos stovas 50x1,5 ml; stovai mėgintuvėliams laikyti 80x1,5 ml;
• reakcijos mišinio paruošimo patalpa: apsauginė kamera PGR dėžutė („Laminar-C. 110 cm“); centrifuga „Vortex“; kintamo tūrio „Proline“ serijos pipetės; pipečių stovas; darbo vietos stovas 200x0,2 ml; stovai mėgintuvėliams laikyti 80x1,5 ml; šaldytuvas, kurio temperatūros diapazonas yra nuo -20 ^° C iki +10 ^° C;
• Elektroforezės patalpa: horizontali elektroforezės kamera; maitinimo šaltinis; transiliuminatorius;
• DNR stiprintuvas arba nukleorūgščių analizatorius (realaus laiko PGR) su kompiuteriu ir programine įranga; gali būti pastatytas bet kurioje laisvoje patalpoje. Jei naudojama realaus laiko PGR technologija, elektroforezės patalpos nereikia.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Išorinė kokybės kontrolė

Siekdamos užtikrinti objektyviai patikimus rezultatus, laboratorijos privalo dalyvauti išorinio laboratorinių tyrimų kokybės vertinimo sistemoje.

Kokybės kontrolės sistemos dalyviai gauna: 12 ampulių su liofilizuotomis bakterijų ląstelių suspensijomis, iš kurių dviejose yra E. coli, 3 ampules su tuberkuliozės mikobakterijomis (avirulentinė padermė), kurių koncentracija yra 102 ^/ ml; 3 ampules su panašios padermės ląstelėmis, kurių koncentracija yra 104 ^/ ml; po 2 ampules su netuberkuliozinėmis mikobakterijomis M. avium-intracellulare ir M. kansasii, kurių koncentracija yra 105 ^/ ml.

Išoriniam kokybės vertinimui siunčiami bandymai yra iš anksto išbandyti dviejose nepriklausomose laboratorijose, turinčiose didelę patirtį šioje srityje.

[ 85 ], [ 86 ]