Kraujodaros kamieninės ląstelės

Hematopoetinės kamieninės ląstelės (HSC), kaip ir mezenchiminės progenitorinės ląstelės, pasižymi daugiapotencialumu ir duoda pradžią ląstelių linijoms, kurių galutiniai elementai sudaro suformuotus kraujo elementus, taip pat daugybę specializuotų imuninės sistemos audinių ląstelių.

Hipotezė apie bendro visų kraujo ląstelių pirmtako egzistavimą, taip pat ir pats terminas „kamieninė ląstelė“, priklauso A. Maksimovui (1909). Ląstelių masės susidarymo potencialas HSC yra milžiniškas – kaulų čiulpų kamieninės ląstelės kasdien pagamina 10 ląstelių, kurios sudaro susiformavusius periferinio kraujo elementus. Pats kraujodaros kamieninių ląstelių egzistavimo faktas buvo nustatytas 1961 m. atliekant eksperimentus, skirtus atkurti kraujodarą pelėms, gavusioms mirtiną radioaktyviosios spinduliuotės dozę, sunaikinančią kaulų čiulpų kamienines ląsteles. Po singeninių kaulų čiulpų ląstelių transplantacijos tokiems mirtinai apšvitintiems gyvūnams, recipientų blužnyje buvo rasti atskiri kraujodaros židiniai, kurių šaltinis buvo pavienės klonogeninės pirmtakinės ląstelės.

Tuomet buvo įrodytas kraujodaros kamieninių ląstelių gebėjimas savarankiškai apsivaldyti, užtikrinant kraujodaros funkciją ontogenezės procese. Embriono vystymosi procese HSC pasižymi dideliu migracijos aktyvumu, būtinu joms judėti į kraujodaros organų formavimosi zonas. Ši HSC savybė išsaugoma ir ontogenezėje – dėl nuolatinės migracijos vyksta nuolatinis imunokompetenčių ląstelių telkinio atsinaujinimas. HSC gebėjimas migruoti, prasiskverbti pro histohematinius barjerus, implantuotis į audinius ir klonogeniškai augti buvo kaulų čiulpų ląstelių transplantacijos pagrindas sergant daugeliu ligų, susijusių su kraujodaros sistemos patologija.

Kaip ir visi kamieninių ląstelių ištekliai, hematopoetinės kamieninės ląstelės savo nišoje (kaulų čiulpuose) yra labai mažais kiekiais, todėl jas sunku išskirti. Imunofenotipiškai žmogaus HSC apibūdinamos kaip CD34+ NK ląstelės, galinčios migruoti į kraują ir užpildyti imuninės sistemos organus arba atkurti kaulų čiulpų stromą. Reikėtų aiškiai suprasti, kad HSC nėra pačios nesubrendusios kaulų čiulpų ląstelės, o yra kilusios iš pirmtakų, tarp kurių yra ir ramybės būsenos fibroblastus primenančios CD34 neigiamos ląstelės. Nustatyta, kad ląstelės su CD34 fenotipu gali patekti į bendrą kraujotaką, kur jos pakeičia savo fenotipą į CD34+, tačiau atvirkštinės migracijos į kaulų čiulpus metu, veikiamos mikroaplinkos, jos vėl tampa CD34 neigiamais kamieninių ląstelių elementais. Ramybės būsenoje CD34~ ląstelės nereaguoja į parakrininius stromos reguliavimo signalus (augimo faktorius, citokinus). Tačiau situacijose, kai reikalingas padidėjęs kraujodaros intensyvumas, kamieninės ląstelės su CD34 fenotipu reaguoja į diferenciacijos signalus formuodamos tiek hematopoetines, tiek mezenchimines pirmtakines ląsteles. Hematopoezė vyksta tiesiogiai kontaktuojant su HSC su kaulų čiulpų stromos ląsteliniais elementais, kuriuos sudaro sudėtingas makrofagų, tinklinių endotelio ląstelių, osteoblastų, stromos fibroblastų ir tarpląstelinės matricos tinklas. Kaulų čiulpų stromos pagrindas yra ne tik hematopoetinio audinio matrica arba „skeletas“; jis atlieka tikslų kraujodaros reguliavimą dėl parakrininių augimo faktorių, citokinų ir chemokinų reguliavimo signalų, taip pat užtikrina adhezinę sąveiką, būtiną kraujo ląstelių susidarymui.

Taigi, nuolat atsinaujinanti kraujodaros sistema yra pagrįsta polipotentinėmis (kraujodaros požiūriu) kraujodaros kamieninėmis ląstelėmis, gebančiomis ilgai save palaikyti. Įsipareigojimo procese HSC patiria pirminę diferenciaciją ir sudaro ląstelių klonus, kurie skiriasi citomorfologinėmis ir imunofenotipinėmis savybėmis. Nuoseklus primityvių ir įsipareigojusių progenitorinių ląstelių formavimasis baigiasi morfologiškai identifikuojamų įvairių kraujodaros linijų progenitorinių ląstelių susidarymu. Vėlesnių sudėtingo daugiapakopio kraujodaros proceso etapų rezultatas yra ląstelių brendimas ir subrendusių susiformavusių elementų – eritrocitų, leukocitų, limfocitų ir trombocitų – išsiskyrimas į periferinį kraują.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Hematopoetinių kamieninių ląstelių šaltiniai

Hematopoetinės kamieninės ląstelės laikomos labiausiai ištirtu kamieninių ląstelių šaltiniu, daugiausia dėl jų klinikinio panaudojimo kaulų čiulpų transplantacijoje. Iš pirmo žvilgsnio apie šias ląsteles žinoma gana daug. Tam tikra prasme tai tiesa, nes tarpiniai ir subrendę HSC palikuonys yra labiausiai prieinami ląsteliniai elementai, kurių kiekvienas (eritrocitai, leukocitai, limfocitai, monocitai/makrofagai ir trombocitai) buvo kruopščiai ištirtas visais lygmenimis – nuo šviesos iki elektroninės mikroskopijos, nuo biocheminių ir imunofenotipinių savybių iki identifikavimo PGR analizės metodais. Tačiau HSC morfologinių, ultrastruktūrinių, biocheminių, imunofenotipinių, biofizinių ir genominių parametrų stebėjimas nedavė atsakymų į daugelį probleminių klausimų, kurių sprendimas yra būtinas ląstelių transplantologijos plėtrai. Hematopoetinių kamieninių ląstelių stabilizavimo ramybės būsenoje, jų aktyvavimo, patekimo į simetrinio ar asimetrinio dalijimosi stadiją ir, svarbiausia, įsipareigojimo formuoti tokius funkciškai skirtingus suformuotus kraujo elementus kaip eritrocitai, leukocitai, limfocitai ir trombocitai, mechanizmai dar nėra nustatyti.

Kaulų čiulpuose aptikus ląsteles su CD34 fenotipu, kurios yra tiek mezenchiminių, tiek hematopoetinių kamieninių ląstelių pirmtakai, iškilo klausimas dėl ankstyviausių ląstelių diferenciacijos į stromos ir hematopoetines linijas pirmtakų, artimų CD34 neigiamoms ląstelėms. Vadinamoji ilgalaikės kultūros inicijavimo ląstelė (LTC-IC) buvo gauta naudojant ilgalaikio kultivavimo metodą. Tokių pirmtakų ląstelių, turinčių kolonijas formuojantį aktyvumą kaulų čiulpų stromos pagrindu su tam tikru augimo faktorių deriniu, gyvavimo trukmė viršija 5 savaites, o įsipareigojusių kolonijas formuojančių vienetų (CFU) gyvybingumas kultūroje yra tik 3 savaitės. Šiuo metu LTC-IC laikoma funkciniu HSC analogu, nes, turint didelį repopuliacijos potencialą, apie 20 % LTC-IC pasižymi CD34+CD38- fenotipu ir pasižymi dideliu gebėjimu atsinaujinti. Tokios ląstelės žmogaus kaulų čiulpuose randamos 1:50 000 dažniu. Tačiau mieloidinius-limfoidinius procesus inicijuojančios ląstelės, gaunamos ilgalaikio (15 savaičių) kultivavimo sąlygomis, turėtų būti laikomos artimiausiomis HSC. Tokios ląstelės, žymimos LTC, yra tarp žmogaus smegenų kaulų čiulpų ląstelių, aptinkamų 10 kartų rečiau nei LTC-IC, ir sudaro tiek mieloidinių, tiek limfoidinių hematopoetinių linijų ląstelių linijas.

Nors hematopoetinių kamieninių ląstelių žymėjimas monokloniniais antikūnais ir vėlesnis imunofenotipinis identifikavimas yra pagrindinis kamieninio potencialo hematopoetinių ląstelių atpažinimo ir selektyvaus rūšiavimo metodas, tokiu būdu išskirtų HSC klinikinis pritaikymas yra ribotas. CD34 receptoriaus ar kitų žymenų antigenų blokavimas antikūnais imunopozityvaus rūšiavimo metu neišvengiamai pakeičia jų pagalba išskirtos ląstelės savybes. Imunonegatyvus HSC išskyrimas ant magnetinių kolonėlių laikomas tinkamesniu. Tačiau šiuo atveju rūšiavimui dažniausiai naudojami ant metalinio nešiklio pritvirtinti monokloniniai antikūnai. Be to, svarbu tai, kad abu HSC išskyrimo metodai yra pagrįsti fenotipinėmis, o ne funkcinėmis savybėmis. Todėl daugelis tyrėjų renkasi HSC klonogeninių parametrų analizę, kuri leidžia nustatyti progenitorinių ląstelių brandos laipsnį ir diferenciacijos kryptį pagal kolonijų dydį ir sudėtį. Yra žinoma, kad kaupimosi proceso metu ląstelių skaičius ir jų tipai kolonijoje mažėja. Hematopoetinė kamieninė ląstelė ir jos ankstyvoji dukterinė ląstelė, vadinama „granulocitų-eritrocitų-monocitų-megakariocitų kolonijas formuojančiu vienetu“ (CFU-GEMM), kultūroje sukuria dideles daugialinijines kolonijas, kuriose yra atitinkamai granulocitų, eritrocitų, monocitų ir megakariocitų. Granulocitų-monocitų kolonijas formuojantis vienetas (CFU-GM), esantis pasroviui išilgai įsipareigojimo linijos, sudaro granulocitų ir makrofagų kolonijas, o granulocitų kolonijas formuojantis vienetas (CFU-G) sudaro tik nedidelę subrendusių granulocitų koloniją. Ankstyvasis eritrocitų pirmtakas, eritrocitų sprogstamasis formuojantis vienetas (CFU-E), yra didelių eritrocitų kolonijų šaltinis, o labiau subrendęs eritrocitų kolonijas formuojantis vienetas (CFU-E) yra mažų eritrocitų kolonijų šaltinis. Apskritai, kai ląstelės auga pusiau kietoje terpėje, galima identifikuoti ląsteles, kurios sudaro šešių tipų mieloidines kolonijas: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E ir CFU-E.

Tačiau, be hematopoetinių darinių, bet kokia HSC išskyrimo medžiaga turi nemažai lydinčių ląstelių. Šiuo atžvilgiu pirmiausia būtina atlikti preliminarų transplantato išgryninimą iš aktyvių donoro imuninės sistemos ląstelių. Paprastai šiam tikslui naudojama imunoselekcija, pagrįsta specifinių antigenų ekspresija limfocituose, kuri leidžia juos išskirti ir pašalinti naudojant monokloninius antikūnus. Be to, buvo sukurtas imunorozetės metodas T limfocitų pašalinimui iš kaulų čiulpų transplantato, pagrįstas CD4+ limfocitų ir specifinių monokloninių antikūnų kompleksų, efektyviai pašalinamų naudojant aferezę, susidarymu. Šis metodas užtikrina išgrynintos ląstelinės medžiagos, kurioje yra 40–60 % hematopoetinių kamieninių ląstelių, gamybą.

Progenitorinių ląstelių skaičiaus padidėjimas dėl subrendusių susiformavusių kraujo elementų pašalinimo iš leukaferezės produkto pasiekiamas priešsroviniu centrifugavimu, po kurio seka filtravimas (esant chelatoriui – trinatrio citratui) per kolonėles, kuriose yra nailono pluoštų, padengtų žmogaus imunoglobulinu. Nuoseklus šių dviejų metodų taikymas užtikrina visišką transplantato išvalymą nuo trombocitų, 89 % nuo eritrocitų ir 91 % nuo leukocitų. Dėl žymiai sumažėjusio HSC praradimo, CD34+ ląstelių kiekis bendroje ląstelių masėje gali būti padidintas iki 50 %.

Izoliuotų kraujodaros kamieninių ląstelių gebėjimas kultūroje sudaryti subrendusių kraujo ląstelių kolonijas naudojamas ląstelių funkciniam apibūdinimui. Susiformavusių kolonijų analizė leidžia nustatyti ir kiekybiškai įvertinti progenitorinių ląstelių tipus, jų įsipareigojimo laipsnį ir diferenciacijos kryptį. Klonogeninis aktyvumas nustatomas pusiau kietoje terpėje ant metilceliuliozės, agaro, plazmos arba fibrino gelio, kuri sumažina ląstelių migracijos aktyvumą, neleisdama joms prisitvirtinti prie stiklo ar plastiko paviršiaus. Optimaliomis auginimo sąlygomis klonai iš vienos ląstelės išsivysto per 7–18 dienų. Jei klone yra mažiau nei 50 ląstelių, jis identifikuojamas kaip vienas klasteris; jei ląstelių skaičius viršija 50, jis identifikuojamas kaip kolonija. Atsižvelgiama į ląstelių, galinčių sudaryti koloniją, skaičių (kolonijas formuojančius vienetus – KSV arba kolonijas formuojančias ląsteles – KOL). Reikėtų pažymėti, kad KSV ir KOL parametrai neatitinka HSC skaičiaus ląstelių suspensijoje, nors jie su juo koreliuoja, o tai dar kartą pabrėžia poreikį nustatyti HSC funkcinį (kolonijas formuojantį) aktyvumą in vitro.

Tarp kaulų čiulpų ląstelių didžiausią proliferacinį potencialą turi kraujodaros kamieninės ląstelės, dėl kurių jos sudaro didžiausias kolonijas kultūroje. Siūloma, kad tokių kolonijų skaičius netiesiogiai leistų nustatyti kamieninių ląstelių skaičių. In vitro suformavus kolonijas, kurių skersmuo didesnis nei 0,5 mm, o ląstelių skaičius didesnis nei 1000, autoriai ištyrė tokių ląstelių atsparumą subletalinėms 5-fluorouracilo dozėms ir ištyrė jų gebėjimą atkurti mirtinai apšvitintų gyvūnų kaulų čiulpus. Pagal nurodytus parametrus išskirtos ląstelės beveik nesiskyrė nuo HSC ir gavo santrumpos simbolį HPP-CFC – kolonijas formuojančios ląstelės, turinčios didelį proliferacinį potencialą.

Toliau ieškoma būdų, kaip išskirti geresnės kokybės kraujodaros kamienines ląsteles. Tačiau kraujodaros kamieninės ląstelės yra morfologiškai panašios į limfocitus ir sudaro santykinai homogenišką ląstelių rinkinį su beveik apvaliais branduoliais, smulkiai disperguota chromatine medžiaga ir nedideliu kiekiu silpnai bazofilinės citoplazmos. Tikslų jų skaičių taip pat sunku nustatyti. Manoma, kad HSC žmogaus kaulų čiulpuose aptinkama 1 iš 106 branduolinių ląstelių.

Hematopoetinių kamieninių ląstelių identifikavimas

Siekiant pagerinti kraujodaros kamieninių ląstelių identifikavimo kokybę, atliekamas nuoseklus arba vienalaikis (daugiakanaliu rūšiuotuvu) membranoje surištų antigenų spektro tyrimas, o HSC atveju CD34+CD38 fenotipas turėtų būti derinamas su linijinių diferenciacijos žymenų, ypač imunokompetentinių ląstelių antigenų, tokių kaip CD4, paviršiaus imunoglobulinai ir glikoforinas, nebuvimu.

Beveik visos kraujodaros kamieninių ląstelių fenotipavimo schemos apima CD34 antigeno nustatymą. Šis glikoproteinas, kurio molekulinė masė yra apie 110 kDa ir kuris turi kelias glikozilinimo vietas, yra ekspresuojamas plazminių ląstelių membranoje aktyvavus atitinkamą geną, lokalizuotą 1 chromosomoje. CD34 molekulės funkcija yra susijusi su L-selektino tarpininkaujama ankstyvųjų kraujodaros kamieninių ląstelių sąveika su kaulų čiulpų stromos pagrindu. Tačiau reikia nepamiršti, kad CD34 antigeno buvimas ląstelės paviršiuje leidžia tik preliminariai įvertinti HSC kiekį ląstelių suspensijoje, nes jį taip pat ekspresuoja kitos kraujodaros kamieninės ląstelės, taip pat kaulų čiulpų stromos ląstelės ir endotelio ląstelės.

Hematopoetinių progenitorinių ląstelių diferenciacijos metu CD34 raiška yra visam laikui sumažėjusi. Eritrocitų, granulocitų ir monocitinių ląstelių pirmtakinės ląstelės silpnai ekspresuoja CD34 antigeną arba visai jo neekspresuoja savo paviršiuje (CD34 fenotipas). CD34 antigeno neaptinkama diferencijuotų kaulų čiulpų ląstelių ir subrendusių kraujo ląstelių paviršiaus membranose.

Reikėtų pažymėti, kad hematopoetinių progenitorinių ląstelių diferenciacijos dinamikoje ne tik mažėja CD34 ekspresijos lygis, bet ir progresyviai didėja CD38 antigeno, integralinio membraninio glikoproteino, kurio molekulinė masė yra 46 kDa ir kuris pasižymi NAD-glikohidrolazės ir ADP-ribozilciklazės aktyvumu, ekspresja, o tai rodo jo dalyvavimą ADP-ribozės transportavime ir sintezėje. Taigi, atsiranda galimybė dvigubai kontroliuoti hematopoetinių progenitorinių ląstelių įsipareigojimo laipsnį. Ląstelių, turinčių CD34+CD38+ fenotipą, populiacijoje, kuri sudaro nuo 90 iki 99 % CD34 teigiamų kaulų čiulpų ląstelių, yra progenitorinių ląstelių, turinčių ribotą proliferacinį ir diferenciacinį potencialą, o ląstelės, turinčios CD34+CD38 fenotipą, gali atlikti HSC vaidmenį.

Iš tiesų, kaulų čiulpų ląstelių populiacijoje, aprašytoje formule CD34+CD38-, yra santykinai daug primityvių kamieninių ląstelių, galinčių diferencijuotis mieloidine ir limfoidine kryptimis. Ilgalaikio ląstelių, turinčių CD34+CD38- fenotipą, kultivavimo sąlygomis galima gauti visus subrendusius susiformavusius kraujo elementus: neutrofilus, eozinofilus, bazofilus, monocitus, megakariocitus, eritrocitus ir limfocitus.

Palyginti neseniai nustatyta, kad CD34 teigiamos ląstelės ekspresuoja dar du žymenis – AC133 ir CD90 (Thy-1), kurie taip pat naudojami kraujodaros kamieninėms ląstelėms identifikuoti. Thy-1 antigenas yra koekspresuojamas kartu su CD117 receptoriumi (c-kit) kaulų čiulpų, virkštelės ir periferinio kraujo CD34+ ląstelėse. Tai paviršinis fosfatidilinozitolį jungiantis glikoproteinas, kurio molekulinė masė yra 25–35 kDa, kuris dalyvauja ląstelių adhezijos procesuose. Kai kurie autoriai mano, kad Thy-1 antigenas yra nesubrendusiausių CD34 teigiamų ląstelių žymuo. Savaime besidauginančios ląstelės, turinčios CD34+Thy-1+ fenotipą, sukuria ilgalaikes kultivuojamas linijas su dukterinėmis ląstelėmis. Manoma, kad Thy-1 antigenas blokuoja reguliavimo signalus, kurie sukelia ląstelių dalijimosi sustojimą. Nepaisant to, kad CD34+Thy1+ ląstelės gali pačios daugintis ir kurti ilgalaikes kultivuojamas linijas, jų fenotipo negalima priskirti vien HSC, nes Thy-1+ kiekis bendroje CD34 teigiamų ląstelių elementų masėje sudaro apie 50%, o tai žymiai viršija hematopoetinių ląstelių skaičių.

Labiau perspektyvus kraujodaros kamieninių ląstelių identifikavimui turėtų būti pripažintas AC133 – kraujodaros progenitorinių ląstelių antigeno žymuo, kurio raiška pirmą kartą buvo aptikta embrioninėse kepenų ląstelėse. AC133 yra transmembraninis glikoproteinas, kuris atsiranda ląstelės membranos paviršiuje ankstyviausiose HSC brendimo stadijose – gali būti, kad net anksčiau nei CD34 antigenas. A. Petrenko, V. Griščenkos (2003) tyrimuose nustatyta, kad AC133 ekspresuoja iki 30 % CD34 teigiamų embrioninių kepenų ląstelių.

Taigi, idealus hematopoetinių kamieninių ląstelių fenotipinis profilis, remiantis dabartinėmis koncepcijomis, susideda iš ląstelės kontūro, kurio kontūruose turėtų būti CD34, AC133 ir Thy-1 antigenų konfigūracijos, tačiau nėra vietos CD38, HLA-DR ir linijinės diferenciacijos žymenų GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 molekulinėms projekcijoms.

HSC fenotipinio portreto variacija gali būti CD34+CD45RalowCD71low derinys, nes šia formule aprašytų ląstelių savybės nesiskiria nuo ląstelių, turinčių CD34+CD38 fenotipą, funkcinių parametrų. Be to, žmogaus HSC galima identifikuoti pagal fenotipinius požymius CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit/low – tik 30 tokių ląstelių visiškai atkuria kraujodarą mirtinai apšvitintose pelėse.

40 metų trukęs intensyvus HSC, gebančių tiek savarankiškai daugintis, tiek diferencijuotis į kitus ląstelių elementus, tyrimas prasidėjo nuo bendrųjų kaulų čiulpų ląstelių fenotipinių savybių analizės, kuri leido pateisinti kaulų čiulpų transplantacijos taikymą įvairioms kraujodaros sistemos patologijoms gydyti. Vėliau atrasti nauji kamieninių ląstelių tipai dar nebuvo plačiai naudojami klinikinėje praktikoje. Tuo pačiu metu virkštelės kraujo ir embrioninių kepenų kamieninės ląstelės gali žymiai išplėsti ląstelių transplantacijos mastą ne tik hematologijoje, bet ir kitose medicinos srityse, nes jos skiriasi nuo kaulų čiulpų HSC tiek kiekybinėmis, tiek kokybinėmis savybėmis.

Transplantacijai reikalingas kraujodaros kamieninių ląstelių masės tūris paprastai gaunamas iš kaulų čiulpų, periferinio ir virkštelės kraujo bei embrioninių kepenų. Be to, kraujodaros kamienines ląsteles galima gauti in vitro dauginant ESC ir vėliau nukreipiant jų diferenciaciją į kraujodaros ląstelinius elementus. A. Petrenko, V. Griščenko (2003) teisingai pastebi reikšmingus skirtingos kilmės HSC imunologinių savybių ir gebėjimo atkurti kraujodarą skirtumus, kurie atsiranda dėl nevienodo ankstyvųjų pluripotentinių ir vėlyvųjų kamieninių ląstelių, esančių jų šaltiniuose, santykio. Be to, iš skirtingų kamieninių šaltinių gautoms kraujodaros kamieninėms ląstelėms būdingos kiekybiškai ir kokybiškai visiškai skirtingos nehematopoetinių ląstelių asociacijos.

Kaulų čiulpai jau tapo tradiciniu kraujodaros kamieninių ląstelių šaltiniu. Kaulų čiulpų ląstelių suspensija gaunama iš klubakaulio arba krūtinkaulio, plaunant juos taikant vietinę nejautrą. Tokiu būdu gauta suspensija yra heterogeniška ir joje yra HSC, stromos ląstelių elementų, įsipareigojusių mieloidinių ir limfoidinių linijų pirmtakinių ląstelių, taip pat subrendusių susiformavusių kraujo elementų mišinys. Ląstelių, turinčių CD34+ ir CD34+CD38 fenotipus, skaičius tarp kaulų čiulpų mononuklearinių ląstelių yra atitinkamai 0,5–3,6 ir 0–0,5 %. Periferiniame kraujyje po G-CSF sukeltos HSC mobilizacijos yra 0,4–1,6 % CD34+ ir 0–0,4 % CD34+CD38.

Ląstelių, turinčių imunofenotipus CD34+CD38 ir CD34+, procentinė dalis virkštelės kraujyje yra didesnė – 0–0,6 ir 1–2,6 %, o didžiausias jų skaičius nustatomas tarp embrioninių kepenų kraujodaros ląstelių – atitinkamai 0,2–12,5 ir 2,3–35,8 %.

Tačiau transplantuotos medžiagos kokybė priklauso ne tik nuo joje esančių CD34+ ląstelių skaičiaus, bet ir nuo jų funkcinio aktyvumo, kurį galima įvertinti pagal kolonijų susidarymo lygį in vivo (kaulų čiulpų repopulacija mirtinai apšvitintuose gyvūnuose) ir in vitro – pagal kolonijų augimą pusiau skystoje terpėje. Paaiškėjo, kad iš embriono kepenų, vaisiaus kaulų čiulpų ir virkštelės kraujo išskirtų hematopoetinių progenitorinių ląstelių, turinčių CD34+CD38 HLA-DR fenotipą, kolonijas formuojantis ir proliferacinis aktyvumas žymiai viršija suaugusiojo kaulų čiulpų ir periferinio kraujo hematopoetinių ląstelių proliferacinį ir kolonijas formuojantį potencialą. Kiekybinė ir kokybinė įvairios kilmės HSC analizė atskleidė reikšmingus skirtumus tiek jų santykiniame kiekyje ląstelių suspensijoje, tiek funkcinėse galimybėse. Didžiausias CD34+ ląstelių skaičius (24,6%) rastas transplantuotoje medžiagoje, gautoje iš vaisiaus kaulų čiulpų. Suaugusiojo kaulų čiulpuose yra 2,1% CD34 teigiamų ląstelinių elementų. Tarp suaugusiojo periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių tik 0,5% turi CD34+ fenotipą, o virkštelės kraujyje jų skaičius siekia 2%. Tuo pačiu metu vaisiaus kaulų čiulpų CD34+ ląstelių kolonijų formavimo pajėgumas yra 2,7 karto didesnis nei suaugusiojo kaulų čiulpų kraujodaros ląstelių kloninio augimo pajėgumas, o virkštelės kraujo ląstelės sudaro žymiai daugiau kolonijų nei kraujodaros elementai, išskirti iš suaugusiųjų periferinio kraujo: atitinkamai 65,5 ir 40,8 kolonijos / 10⁻⁶ ląstelių.

Hematopoetinių kamieninių ląstelių proliferacinio aktyvumo ir kolonijas formuojančio pajėgumo skirtumai yra susiję ne tik su skirtingu jų brandos laipsniu, bet ir su jų natūralia mikroaplinka. Yra žinoma, kad kamieninių ląstelių proliferacijos intensyvumą ir diferenciacijos greitį lemia daugiakomponentės augimo faktorių ir citokinų sistemos, kurią gamina tiek pačios kamieninės ląstelės, tiek jų matricos-stromos mikroaplinkos ląsteliniai elementai, integralus reguliavimo poveikis. Išgrynintų ląstelių populiacijų ir serumo neturinčių terpių naudojimas ląstelių kultivavimui leido apibūdinti augimo faktorius, kurie stimuliuoja ir slopina įvairaus lygio kamienines ląsteles, progenitorines ląsteles ir ląsteles, išsidėsčiusias viena ar kita tiesine kryptimi. Tyrimų rezultatai įtikinamai rodo, kad HSC, gautos iš skirtingų ontogenetinio išsivystymo lygių šaltinių, skiriasi tiek fenotipiškai, tiek funkciškai. Ankstyvosiose ontogenezės stadijose esančios HSC pasižymi dideliu savęs dauginimosi potencialu ir dideliu proliferaciniu aktyvumu. Tokios ląstelės pasižymi ilgesnėmis telomeromis ir yra įsipareigojusios formuoti visas hematopoetines ląstelių linijas. Imuninės sistemos atsakas į embrioninės kilmės HSC yra uždelstas, nes tokios ląstelės silpnai ekspresuoja HLA molekules. Pastebima aiški HSC santykinio kiekio, jų atsinaujinimo gebėjimo ir jų formuojamų įsipareigojimų linijų tipų skaičiaus gradacija: embrioninių kepenų CD34+ ląstelės > virkštelės kraujo CD34+ ląstelės > kaulų čiulpų CD34+ ląstelės. Svarbu tai, kad tokie skirtumai būdingi ne tik intra-, neo- ir ankstyvajam postnataliniam žmogaus vystymosi laikotarpiams, bet ir visai ontogenezei – iš suaugusiojo kaulų čiulpų arba periferinio kraujo gautų HSC proliferacinis ir kolonijas formuojantis aktyvumas yra atvirkščiai proporcingas donoro amžiui.